生物素化脂質(zhì)體促進胰島素口服吸收的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)和肽類藥物口服給藥一直是藥劑學(xué)研究的熱點和難點，也是醫(yī)藥領(lǐng)域最具挑戰(zhàn)的前沿課題之一。然而，若要實現(xiàn)有效的口服遞送，必須克服該類藥物穩(wěn)定性差、胃腸道酶降解、膜滲透性差等多重障礙。近年來，以胰島素為主要模型藥物，發(fā)展了尤其包括納米遞送系統(tǒng)在內(nèi)的多種促進吸收策略。然而，目前的研究現(xiàn)狀表明在提高胰島素口服生物利用度方面似乎遇到了一個瓶頸，因此亟待探索新的方法和策略以進一步增強這些納米給藥系統(tǒng)促進吸收的作用。本文的主要學(xué)術(shù)思路在于以生物素(

2、biotin)修飾脂質(zhì)體，藉胃腸道上皮的生物素受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機制，促進胰島素的口服吸收，并對其口服吸收機制進行探索與驗證。
　　脂質(zhì)體的生物素化通過在脂質(zhì)體雙分子層膜上嵌入生物素-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(biotin-DSPE)而達成。Biotin-DSPE通過生物素的羧基與DSPE氨基的酰胺化反應(yīng)合成，產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)經(jīng)TLC、FTIR和1H NMR分析驗證。
　　采用逆向蒸發(fā)/超聲分散法制備載胰島素生物素化脂質(zhì)體，以包封率和粒徑

3、為指標，分別考察了藥物/脂質(zhì)比、磷脂/膽固醇比、初乳制備時有機相/水相體積比和脂質(zhì)體水化時介質(zhì)pH值等影響因素，對制備條件進行優(yōu)化。優(yōu)選條件下制備的生物素化脂質(zhì)體胰島素包封率可達30％以上，脂質(zhì)體粒徑在150 nm左右。圓二色譜(CD)檢測結(jié)果表明在各極端制備條件下制備的脂質(zhì)體，胰島素的二級構(gòu)象保持完好;大鼠皮下降糖實驗表明，制劑中胰島素的降糖作用與胰島素溶液無顯著性差異，表明胰島素的生物活性亦得以保存。生物素化可顯著提高脂質(zhì)體的相變溫

4、度，當(dāng)biotin-DSPE占脂質(zhì)比例的20％以上時，其相變溫度可以達到40℃以上。相對于普通脂質(zhì)體，生物素化脂質(zhì)體的體外抗胃腸道酶解能力較強;4℃下短期放置其包封率和粒徑變化較小，表明其穩(wěn)定性較好。
　　正常大鼠模型上驗證了生物素化脂質(zhì)體的口服降血糖作用及其影響因素，并在高血糖大鼠模型上考察了生物素化脂質(zhì)體口服給藥后的大鼠體內(nèi)血糖下降水平和血漿中胰島素濃度變化。結(jié)果表明，在正常大鼠體內(nèi)生物素化脂質(zhì)體比普通脂質(zhì)體具有更加明顯的降血

5、糖作用，其相對藥理生物利用度為11.04％，而普通脂質(zhì)體僅為2.09％。在對生物素化脂質(zhì)體口服降血糖作用的影響因素考察中發(fā)現(xiàn)150 nm左右粒徑的脂質(zhì)體粒徑具有較好的體內(nèi)降血糖效應(yīng)，脂質(zhì)體中biotin-DSPE比例在20％以上時體內(nèi)降血糖效應(yīng)無顯著性差異，在低劑量下脂質(zhì)體降血糖效應(yīng)具有劑量依賴性，高劑量下則具有非線性特點;高血糖大鼠體內(nèi)相對藥理生物利用度則達到12.09％，普通脂質(zhì)體為6.36％;基于血漿胰島素水平的生物利用度為8.4

6、1％，而普通脂質(zhì)體僅有3.44％。結(jié)果表明生物素化脂質(zhì)體能夠顯著地促進胰島素的口服吸收，其作用溫和持久。
　　吸收機制研究方面，首先在Caco-2細胞模型上驗證了胃腸道吸收上皮生物素受體表達。在細胞水平上進行了胰島素生物素化脂質(zhì)體在Caco-2細胞單層上的跨膜轉(zhuǎn)運研究，并通過TEER值的測定和CLSM觀察考察了脂質(zhì)體對Caco-2細胞單層生理功能和緊密連接的影響，結(jié)果表明胰島素在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下其跨膜轉(zhuǎn)運能力得到顯著改善，尤其是生物

7、素修飾脂質(zhì)體，其表觀滲透系數(shù)(Papp)是普通脂質(zhì)體的1.87倍;脂質(zhì)體對細胞緊密連接無顯著的影響。脂質(zhì)體的細胞攝取研究表明脂質(zhì)體生物素化后促進了標記物的細胞攝取量以及脂質(zhì)體的內(nèi)化，并具有溫度依賴性和與生物素競爭抑制性，這表明生物素化脂質(zhì)體與普通脂質(zhì)體之間存在不同的細胞攝取機制。在隨后的細胞內(nèi)吞機制研究中發(fā)現(xiàn)，生物素化脂質(zhì)體的內(nèi)化是通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(clathrin-mediated endocytosis)途徑實現(xiàn)的，這些結(jié)果說

8、明生物素化脂質(zhì)體的吸收是有生物素配體介導(dǎo)的、消耗能量的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運過程。CLSM熒光共區(qū)域化研究表明，脂質(zhì)體是以完整納米粒進入細胞的，在細胞內(nèi)經(jīng)歷了早期內(nèi)含體、后期內(nèi)含體和溶酶體的遞送過程，這是受體介導(dǎo)內(nèi)吞典型的轉(zhuǎn)運特征。在組織水平上，還進行了脂質(zhì)體胃腸道轉(zhuǎn)運的實時離體成像觀察和跨上皮吸收的免疫熒光觀察，離體成像研究表明生物素化脂質(zhì)體在胃腸道中具有較快的轉(zhuǎn)運速率，熒光免疫組化分析也表明了生物素化脂質(zhì)體具有更好的上皮細胞膜滲透性。因而，對吸收

9、機制研究結(jié)果總結(jié)如下:生物素化脂質(zhì)體促進胰島素口服吸收的機制主要是通過細胞通路途徑(transcellular)由生物素配體介導(dǎo)的內(nèi)吞機制，而不是通過細胞旁路途徑(paracellular)打開細胞間緊密連接機制。盡管胃腸道對生物素化脂質(zhì)體的吸收主要由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞完成的，但它的吸收是一個協(xié)同的過程，可能還伴隨著經(jīng)M-細胞吸收的淋巴轉(zhuǎn)運過程，這是基于脂質(zhì)體納米給藥系統(tǒng)本身的貢獻。
　　通過MTT細胞活力測定和細胞凋亡實驗考察了脂質(zhì)