提高破傷風(fēng)類毒素免疫原性的初步研究.pdf

1、破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生的破傷風(fēng)毒素，經(jīng)0.4％甲醛滅活后，失去毒性而仍保留抗原性稱之為破傷風(fēng)類毒素。類毒素精制后，可作為疫苗對(duì)人和動(dòng)物進(jìn)行免疫接種。但機(jī)體感染后不能獲得終身免疫力，且此免疫程序較長(zhǎng)。為了減輕接種的副反應(yīng)，提高免疫效果，減少注射次數(shù)，提高接種覆蓋率，本研究采用原核細(xì)胞表達(dá)具有高免疫原性的重組C蛋白，用于生產(chǎn)疫苗及免疫接種，以避免出現(xiàn)副作用；另外，用雙功能交聯(lián)劑戊二醛聚合破傷風(fēng)毒素，使毒素分子之間進(jìn)行交聯(lián)，從而產(chǎn)生分子量較大的，表面

2、決定簇多的聚合類毒素。該類毒素作為免疫的抗原，可以誘發(fā)較高的抗體水平，加強(qiáng)免疫記憶，延長(zhǎng)保護(hù)機(jī)體免受破傷風(fēng)的侵害的時(shí)間。 1.利用PCR技術(shù)從破傷風(fēng)梭菌基因組DNA中擴(kuò)增出1356bp的破傷風(fēng)毒素C基因，將該基因片段插入到表達(dá)載體pET32a(+)中，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，觀察各種條件下對(duì)重組菌蛋白表達(dá)的影響。對(duì)重組后蛋白用Ni-NAT親和層析的技術(shù)純化C融合蛋白，然后進(jìn)行小鼠免疫實(shí)驗(yàn)并測(cè)定效價(jià)。研

3、究顯示：經(jīng)SDS-PAGE分析，重組破傷風(fēng)毒素C蛋白(rTTC)的表達(dá)量占可溶性蛋白的28.19％，純化后得到蛋白純度為96.92％。免疫印跡證實(shí)該重組蛋白是破傷風(fēng)毒素C蛋白抗原，對(duì)小鼠免疫，三免后14drTTC組小鼠抗體效價(jià)仍能達(dá)到1∶16000。所獲得的重組蛋白具有良好的免疫原性。 2.經(jīng)過厭氧培養(yǎng)的破傷風(fēng)梭菌，產(chǎn)毒后進(jìn)行脫毒、精制，在產(chǎn)毒期間進(jìn)行毒力鑒定、解毒和毒性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。再由戊二醛聚合破傷風(fēng)類毒素，經(jīng)不同的聚合條件的優(yōu)

4、化，進(jìn)行分子量和Lf的測(cè)定，然后免疫小鼠和兔子，并測(cè)定其免疫效價(jià)。培養(yǎng)的毒素可以作為制備類毒素使用，脫毒精制后的類毒素，經(jīng)毒力鑒定試驗(yàn)、解毒試驗(yàn)和毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)檢測(cè)后均合格。用pH7.2的PBS稀釋類毒素，終濃度為0.1％、0.3％戊二醛置于室溫中聚合稀釋后的類毒素12h，聚合類毒素中聚合的類毒素分子量為600ku，含量占聚合物的43.82％，經(jīng)ELISA檢測(cè)抗原性，抗原與陽(yáng)性血清呈陽(yáng)性反應(yīng)。免疫小鼠和兔子，平均效價(jià)在1∶20000～1∶