新型免疫刺激分子增強DNA疫苗免疫原性的研究.pdf

1、hsp65作為DNA疫苗的模式抗原是機體對抗結核分枝桿菌入侵的重要免疫保護性及治療抗原。然而,增強DNA疫苗免疫效果則是令人期待的。因此我們構建麻風分枝桿菌熱休克蛋白65(Heat shock protein65,Hsp65)的原核表達載體,誘導表達、純化該重組蛋白并制備Anti-Hsp65小鼠多克隆抗體；并探討在麻風分枝桿菌熱休克蛋白Hsp65終止密碼與真核表達載體:polyA之間插入CpG基序以提高DNA疫苗在小鼠中誘導的細胞免疫和

2、體液免疫；同時探討以內含子A增強Hsp65在真核細胞中的表達效率及提高DNA疫苗在小鼠中誘導的免疫原性。通過ELISA、ELISPOT和胞內細胞因子染色技術等實驗方法進行分析,結果小結如下:
　　 1、PCR擴增所獲得hsp65基因序列與GenBank公布的完全一致,表達的融合蛋白相對分子質量約65 kDa,ELISA測定表明Anti—Hsp65多克隆抗體效價約為1:12,800,Western-blotting分析表明該多克隆

3、抗體具有良好的反應特異性；
　　 2、含有CpGO2的重組質粒瞬時轉染小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞,其IFN-α,IL-12,IL-17A和IL-6的mRNA相對表達水平明顯增加,但IL-4和CD86的mRNA相對表達水平沒有統計學差異,免疫小鼠后誘導產生.Anti—Hsp65特異性總IgG和IgG2a抗體水平也更高,分泌IFN-γ的T淋巴細胞頻率也增加；
　　 3、含有內含子A的重組表達質粒pCMV4.0hsp6

4、5較之不含內含子A的pVAX1hsp65在人胚腎上皮細胞系293T細胞中的抗原表達量更高,免疫小鼠后誘導產生的Anti-Hsp65特異性總IgG和IgG2a抗體水平也更高,分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T淋巴細胞頻率增加。
　　 經過上述驗證,我們成功表達與純化了麻風分枝桿菌Hsp65的重組蛋白,并制備了效價及特異性良好的Anti-Hsp65小鼠多克隆抗體；在抗原轉錄區(qū)下游插入CpG免疫刺激基序能更好地提高DNA疫苗在小鼠中