未折疊蛋白反應在白內障發(fā)病機制中作用的實驗研究.pdf

1、目的: 自1972年Kerr首次發(fā)現細胞凋亡以來，有關細胞凋亡與白內障的關系一直在探討中。目前認為晶狀體上皮細胞的凋亡是除先天性白內障以外所有類型白內障形成的細胞學基礎。研究晶狀體上皮細胞的凋亡機制成為研究各型白內障形成機制的熱點。內質網是細胞內蛋白質折疊的場所，在低氧、葡萄糖饑餓、氧化及糖基化作用紊亂等內質網刺激因子作用下，大量未折疊蛋白在內質網中堆積，產生一條稱為未折疊蛋白反應的自我保護信號轉導通路，應激信號通過內質網傳送進

2、入細胞核中，最終使細胞產生生存適應或誘導細胞凋亡。因此未折疊蛋白反應在應激細胞的轉歸中起重要作用。本課題通過內質網應激刺激因子作用于晶狀體上皮細胞，試圖了解內質網應激導致的未折疊蛋白反應是否誘導晶狀體上皮細胞的凋亡，從而探討未折疊蛋白反應與白內障發(fā)病機制的關系。 方法: 將晶狀體上皮細胞分為對照組和實驗組A、B、C、D組，分別用0、1、2、5、10mmol/L的同型半胱氨酸(Hcy)作用于細胞24小時。應用MTT法檢測不

3、同濃度藥物刺激后的細胞增殖抑制率；應用Hoechst33258熒光染色檢測細胞凋亡率；應用活性氧熒光探針DCFH-DA檢測刺激后細胞中活性氧產物(ROS)；應用GSH檢測試劑盒檢測刺激后細胞中還原型谷胱甘肽(GSH)的含量；應用Western blot技術檢測刺激后細胞中的GRP78，caspase-12的表達。 結果: 1.不同濃度同型半胱氨酸對細胞增殖抑制率的影響：Hcy刺激細胞24h后，顯微鏡下可見對照組、實驗A、

4、B組細胞均貼壁生長，形態(tài)無明顯變化；實驗C、D組細胞可見部分漂浮，其中D組細胞貼壁少，細胞死亡過半。細胞活力呈濃度依賴性下降，其中5mmol/L，10mmol/LHcy可使細胞活性下降48.3％，57.7％，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 2.不同濃度同型半胱氨酸對細胞凋亡的影響：熒光顯微鏡下可見對照組與實驗A、B組細胞無明顯凋亡發(fā)生，核呈彌散均勻的藍色熒光，實驗C組細胞體積縮小，核凝聚變小，核或細胞質內可見濃

5、染致密的顆粒塊狀熒光，且熒光強度比正常細胞要強。實驗D組由于細胞貼壁少，無熒光結果顯示。 3.不同濃度同型半胱氨酸對細胞內ROS形成的影響：熒光顯微鏡下可見，對照組細胞基本無熒光顯現，實驗組均可見綠色熒光，且熒光強度呈濃度依賴性增加。流式細胞儀檢測的細胞內DCF熒光強度的變化經統(tǒng)計學分析表明，與對照組相比，實驗A、B組的ROS水平的升高無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而實驗C、D組的ROS水平顯著升高(P<0.05)。 4

6、.不同濃度同型半胱氨酸對細胞內GSH的影響：細胞內的GSH含量隨刺激濃度的增加呈濃度依賴性減少。實驗A、B組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；實驗C、D組GSH顯著減少(P<0.05)。 5.細胞內GRP78，caspase-12的表達：實驗組C、D組GRP78蛋白含量較對照組明顯增加，分別為對照組的4.6倍和6.9倍，同時伴隨Caspase-12表達增加，分別為對照組的2.8倍和3.1倍(P<0.05)；而實驗組

7、A、B各指標雖有類似趨勢但變化程度較小，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論: 1.Hcy可誘發(fā)晶狀體上皮細胞產生內質網應激。 2.低濃度的內質網刺激因子會干擾晶狀體上皮細胞內質網穩(wěn)態(tài)，影響蛋白正確修飾與折疊，異常蛋白增多，但通過未折疊蛋白反應的保護作用，細胞中的未折疊蛋白得以清除，細胞產生生存適應。 3.高濃度的內質網刺激因子可刺激晶狀體上皮細胞產生內質網應激，并通過未折疊蛋白反應導致晶狀體上皮細胞