Tim-3表達調控慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞功能的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:通過研究Tim-3對單核細胞功能的調控作用,進一步揭示慢性乙型肝炎的發(fā)病機制,為減輕肝臟炎癥和逆轉病情進展提供免疫治療新靶點。
  方法:1.Tim-3在慢乙肝患者外周血單核細胞中的表達
  1.1收集慢乙肝患者(CHB)和健康對照者(HC)新鮮外周肝素抗凝血,流式細胞術檢測PBMCs中CD14+細胞(單核細胞)表面Tim-3的表達。
  1.2收集慢乙肝患者(CHB)和健康對照者(HC)新鮮外周肝素抗凝血,通過

2、密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞(PBMC),在塑料平皿中貼壁2h后獲取單核細胞(Mo),熒光實時定量PCR技術檢測Tim-3 mRNA在不同分組Mo中的表達。
  1.3 CHB患者外周血單核細胞中Tim-3的表達與外周血清炎癥水平及病毒指標等進行相關性分析。
  2.Tim-3通路對LPS誘導CHB患者外周血單核細胞生成炎癥因子功能的影響
  2.1通過密度梯度離心法和貼壁法獲取CHB患者外周血Mo,實驗分為L

3、PS+Galectin-9組、LPS組和空白組。調整LPS終濃度為1μ g/ml,重組人Galectin-9活性蛋白終濃度為5μg/ml,LPS預先刺激6h后加入重組人Galectin-9活性蛋白共刺激48h。
  2.2 ELISA法檢測各組上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。
  2.3細胞內因子染色法結合流式細胞術分別檢測各組單核細胞中TNF-α+細胞頻數和IL-6+細胞頻數。
  2.4熒光實時定量P

4、CR法檢測各組單核細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達水平。
  3.Tim-3通路對CHB患者單核細胞誘導Th17細胞分化的影響
  3.1密度梯度離心法聯合貼壁法分離CHB患者外周血單核細胞(Mo)與免疫磁珠分選法分離健康人外周血初始CD4+T細胞(Th0)混合培養(yǎng)6d,實驗分為單核細胞+Tim-3阻斷抗體組、單核細胞+丙種球蛋白組、單核細胞組和無單核細胞組四組。
  3.2用ELJSA法分別檢測上

5、述各實驗分組中細胞培養(yǎng)液上清中IL-17含量。
  3.3細胞內因子染色結合流式細胞術分別檢測上述各實驗分組中Th17細胞頻數。
  3.4半定量PCR法分別檢測上述各實驗分組中IL-17AmRNA表達水平。
  結果:1.Tim-3在CHB患者外周血單核細胞中表達上調
  1.1流式細胞術檢測結果顯示,CHB組外周血CD14+Tim-3+細胞頻數顯著高于HC組(X2=144.40,P<0.01)。
  1

6、.2熒光實時定量PCR技術檢測結果顯示,CHB組單核細胞中Tim-3 mRNA的表達顯著高于HC組(t=1.84,P=0.040)。
  1.3統(tǒng)計學分析發(fā)現,CHB組中CDl4+Tim-3+%與外周血清ALT水平成正相關(r=0.362,P=0.028),而與HBV DNA滴度、HbeAg狀態(tài)無明顯相關性。
  2.Tim-3通路可促進LPS刺激單核細胞生成炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)
  2.1 T

7、im-3通路促進LPS誘導CHB外周血單核細胞生成TNF-α統(tǒng)計學分析ELISA結果示LPS組細胞培養(yǎng)上清中TNF-α濃度顯著高于空白組(P=0.036),LPs+Galectin-9組細胞培養(yǎng)上清中TNF-α濃度顯著高于LPS組和空白組(P=0.037,P=0.003),差異均有統(tǒng)計學意義。利用2-△△Ct比較法分別檢測各實驗組中單核細胞TNF-α mRNA的相對表達,統(tǒng)計學分析結果示LPS+Galectin-9組中TNF-α mRN

8、A的表達量顯著高于LPS組和空白組(P=0.044,P=0.037),且LPS組TNF-α mRNA表達量也顯著高于空白組(P=0.001),差異均有統(tǒng)計學意義。流式細胞術結果顯示LPS+Galectin-9組CD14+TNF-α細胞頻數顯著高于空白組(P=0.004),差異有統(tǒng)計學意義,而與LPS組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.563)。
  2.2 Tim-3通路促進LPS誘導CHB外周血單核細胞分泌IL-1β2-△△Ct比

9、較法結果顯示LPS+Galectin-9組IL-1β mRNA的相對表達量顯著高于LPS組和空白組(P=0.026,P=0.014),差異均有統(tǒng)計學意義。ELISA結果類似。
  2.3 Tim-3通路促進LPS誘導CHB外周血單核細胞分泌IL-6 ELISA法檢測上清液中IL-6含量,結果示LPS及Galectin-9共刺激時IL-6水平明顯高于LPS組和空白組(P=0.014,P=0.000),差異均有統(tǒng)計學意義。熒光實時定量

10、PCR檢測IL-6 mRNA表達量,2-△△Ct比較法結果類似:LPS+Galectin-9組顯著高于LPS組和空白組(P=0.035,P=0.028)。流式細胞術結果顯示LPS+Galectin-9組和LPS組CD14+IL-6+細胞頻數均顯著高于空白組(P=0.033,P=0.019),而CD14+IL-6+細胞頻數在LPS+Galectin-9組和LPS組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.894)。
  3.阻斷單核細胞Tim

11、-3通路可下調其對Th17細胞分化的誘導作用
  3.1細胞內細胞因子染色法結合流式細胞術分別檢測各實驗組中Th17細胞頻數本實驗認定CD3+CD8-IL-17+細胞為Th17細胞。無Mo組中Th17細胞頻數顯著低于Mo組和Mo+丙球組(P=0.002,P=0.004),差異均有統(tǒng)計學意義。Mo+Tim-3阻斷抗體組中Th17細胞頻數顯著低于Mo組和Mo+丙球組(P=0.009,P=0.020),差異均有統(tǒng)計學意義。
  3

12、.2半定量PCR法分別檢測各實驗組中IL-17 mRNA的相對表達量結果使用BandScan軟件進行半定量分析,IL-17與β-actin的灰度值進行對比獲得IL-17電泳條帶的相對灰度值。統(tǒng)計學結果顯示:Mo+Tim-3阻斷抗體組中IL-17mRNA的相對表達量均顯著低于Mo組和Mo+丙球組(P均<0.01),差異均有統(tǒng)計學意義。無Mo組中IL-17mRNA的相對表達量均低于Mo組和Mo+丙球組,差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。

13、
  3.3 ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中IL-17含量結果顯示無Mo組細胞培養(yǎng)上清中IL-17濃度顯著低于Mo組、Mo+丙球組和Mo+Tim-3阻斷抗體組(P=0.019,P=0.005,P=0.004),差異均有統(tǒng)計學意義;Mo+Tim-3阻斷抗體組細胞培養(yǎng)上清中IL-17濃度低于Mo組和Mo+丙球組(P=0.049,P=0.014),差異均有統(tǒng)計學意義。
  結論:1.CHB患者外周血單核細胞表面Tim-3分子表

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