柔紅霉素聯合硼替佐米對Raji細胞增殖、凋亡及bax基因表達的影響.pdf

1、目的:泛素-蛋白酶體通路(UPP)是真核細胞內蛋白質選擇性降解的重要途徑之一,參與細胞蛋白質的穩(wěn)定和降解、基因表達調控、受體胞吞、應激反應及細胞凋亡等多種生理過程。硼替佐米為一種人工合成的硼酸肽類蛋白酶體抑制劑,其通過抑制細胞內蛋白質的降解,從而抑制NF-кB通路,促進P53和Bax蛋白的表達,促進P21、P27蛋白的蓄積,最終引起細胞凋亡。Bax蛋白是Bcl-2家族中一種重要的促凋亡蛋白。Bax蛋白通過BH3結構域與Bcl-2蛋白結合

2、,而抑制其抗凋亡活性,同時Bax蛋白還可移位并插入到線粒體膜中,形成bax通道,從而促進細胞色素c釋放入胞質,而誘導凋亡效應。本實驗是研究硼替佐米聯合一種常用的葸環(huán)類抗腫瘤藥物柔紅霉素,對人Burkitt淋巴瘤細胞系Raji細胞的增殖、凋亡及bax基因表達的影響。為其臨床治療Burkia淋巴瘤提供實驗室數據。
　　 方法:
　　 1.藥物對細胞的增殖抑制率:以臺盼藍拒染法進行活細胞計數,計算柔紅霉素(濃度為0.1μg／m

3、l、0.3μg／ml、O.5μg／ml、0.8μg／ml、1.0μg／ml)和硼替佐米(濃度為10ng／ml、50ng／ml、100nng／ml、300ng／ml、500nng／m1)對Raji細胞12h、24h、36h、48h、60h的增殖抑制率。對照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯合硼替佐米IC25組對Raji細胞12h、24h、36h、48h的抑制率。
　　 2.RT-PCR法檢測bax mR

4、NA的表達:對照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯合硼替佐米IC25組對Raji細胞作用48h后RT—PCR法測定bax mRNA表達的變化。
　　 3.免疫細胞化學法測定Bax蛋白表達:對照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯合硼替佐米ICE5組對Raji細胞作用48h后免疫細胞化學法測定細胞內Bax蛋白表達的變化。
　　 4.流式細胞術Annexin V／PI標記

5、法測定凋亡:對照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯合硼替佐米IC25組對Raji細胞作用48h后流式細胞術測定細胞的凋亡情況。
　　 5.統(tǒng)計分析:所得數據應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件處理,對計量資料,各組之間應用方差齊性檢驗和LSD-t檢驗；計數資料采用X2檢驗,各數據表達均用均數±標準差(x±s)表示。以α=0.01或α=0.05為檢驗水準,P<0.01或P<0.05為差異有顯著性。
　　

6、 結果:
　　 1.臺盼藍拒染法檢測出濃度為0.1μg／ml、0.3μg／ml、0.5μg／ml、0.8μg／ml、1.0μg／ml的柔紅霉素對Raji細胞48h的抑制率分別為(38.72±1.87)％,(48.64±1.65)％,(56.87±2.60)％,(66.38±2.55)％,(75.61±2.59)％,IC50=0.36μg／ml,IC25=0.06μg／ml。各濃度組均之間具有顯著性差異。濃度為10ng／ml、5

7、0ng／ml、100ng／ml、300ng／ml、500ng／ml的硼替佐米對Raji細胞48h的抑制率分別為(5.62±1.86)％,(20.23±0.97)％,(29.01±1.78)％,(72.65±2.45)％,(86.42±2.18)％,IC50=23.6ng／ml,IC25=8.5 ng／ml。各濃度組均之間具有顯著性差異。對照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯合硼替佐米IC25組對gaji細胞4

8、8h增殖抑制率為(2.02±1.06)％,(48.63±2.13)％,(52.32±1.66)％,(76.87±2.67)％,加藥組與對照組均有顯著性差異,聯合用藥組與兩個單藥組之間均有顯著差異。
　　 2.對照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯合硼替佐米IC25組對Raji細胞作用48h后,bax mRNA經RT-PCR擴增后電泳DNA條帶灰度值比值分別為0.554±0.012,0.738+0.02

9、3,1.138±0.064,2.384±0.096,各組之間均有統(tǒng)計學差異。
　　 3.對照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯合硼替佐米IC25組對Raji細胞作用48h后,Bax蛋白經免疫細胞化學染色后,陽性率分別為7.68±1.65、66.54±1.79、72.39±1.95、96.57±2.28,積分分別為12.71±5.74、76.97±25.12、106.78±31.64、172.07±38

10、.54,各組之間陽性率和積分均有統(tǒng)計學差異。
　　 4.流式細胞術Annexin V／PI標記法測定對照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯合硼替佐米IC25組對Raji細胞作用48h后,各組凋亡率分別為(1.23±0.29)％,(38.52±4.23)％,(67.37±3.62)％,(81.63±5.19)％,各組之間均具有統(tǒng)計學差異。
　　 結論:
　　 1.柔紅霉素和硼替佐米能夠抑