硼替佐米增強胃癌細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性及機理研究.pdf

1、目的:胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，特別多見于亞洲國家如中國，日本和韓國。多數(shù)病人在診斷時已屬晚期，聯(lián)合化療的預后很差。目前尚無進展期胃癌的確切有效治療方案。
　　 近年來，生物制劑如單克隆抗體與化療藥物的聯(lián)合在乳腺癌，結腸癌和肺癌的治療中取得顯著的療效。這些結果證實了生物制劑與化療藥物聯(lián)用比單獨化療有效，且進一步提示其它生物制劑如細胞因子等與化學制劑的聯(lián)合也可能有更好的療效。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(Tumor nec

2、rosis factor(TNF)-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)是TNF超家族的成員之一，可與死亡受體結合誘導細胞凋亡。和TNF家族的其它成員不同，TRAIL可誘導多種腫瘤細胞的凋亡，而對正常細胞毒性很輕。更為重要的是，TRAIL誘導的炎癥反應比其它TNF成員輕。TRAIL對腫瘤細胞的選擇性毒性和僅誘導低水平炎癥反應使得它有可能成為有效的特異性抗腫瘤藥物。應用TRAIL受體激動型抗體的臨

3、床實驗研究在一些實體腫瘤中已取得一定療效。
　　 雖然TRAIL對大多數(shù)腫瘤有很好的活性，但研究也發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細胞對TRAIL誘導的凋亡存在天然或獲得性耐藥。全面了解TRAIL耐藥機理是克服耐藥，將TRAIL應用于臨床治療的前提。有報告TRAIL與受體結合可激活NF-κB(nUClear factorkappa—B)，繼而啟動抗凋亡基因的轉錄，阻止細胞發(fā)生凋亡。抑制NF-κB活性可增加一些腫瘤細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性。但

4、是在有些時候，NF-κB失活不能增強TRAIL誘導的凋亡。這些矛盾的結果提示NF-κB活化不能保護所有細胞逃避TRAIL誘導的凋亡。NF—κB在不同腫瘤細胞中對TRAIL誘導凋亡的影響需要進一步研究。
　　 除NF-κB外，其它信號傳導通路也參與TRAIL耐藥。Phosphatidylinositol3-kinase(PI3K)/Akt是重要的信號通路，可調(diào)控細胞生存，增殖及凋亡。它可被多種刺激激活，通常發(fā)揮抗凋亡作用。有報告P

5、I3K/Akt信號通路與TRAIL耐藥有關。使用特異性抑制劑或小RNA干擾阻斷PI3K/Akt通路可逆轉一些細胞對TRAIL的原發(fā)耐藥。
　　 關于增強TRAIL敏感性的研究已在多種腫瘤細胞中進行，如肺癌和結腸癌等。近年來的研究顯示一些化學制劑可增強胃癌細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性，但是目前為止這些制劑都不能用于臨床治療。硼替佐米是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白酶體抑制劑，已經(jīng)被美國食品與藥品管理局(U.S. Food and Drug

6、Administration，F(xiàn)DA)批準用于多發(fā)性骨髓瘤和套細胞淋巴瘤的治療。硼替佐米的主要抗腫瘤功能是阻止NF-κB的抑制體IκB在蛋白酶體中降解，從而阻斷NF-κB活化。有報告硼替佐米可與TRAIL協(xié)同，增強TRAIL對一些原發(fā)耐藥細胞誘導的凋亡，如非小細胞肺癌，卵巢癌和胰腺癌。這些結果鼓勵我們將硼替佐米與TRAIL聯(lián)合用于胃癌的治療。本研究以三種胃癌細胞系為模型，研究硼替佐米對TRAIL誘導細胞凋亡的影響，包括caspase裂解

7、，線粒體膜電位的變化和對凋亡相關蛋白的影響，以及NF—κB和PI3K/Akt通路在TRAIL誘導凋亡中的作用。
　　 材料與方法:
　　 1.采用MTT方法測定細胞活力，繪制生存曲線。
　　 2.采用流式細胞術PI染色進行細胞凋亡及細胞周期檢測。
　　 3.采用流式細胞術DiOC6染色測定線粒體膜電位變化。
　　 4.采用Western blot法檢測蛋白的表達。
　　 5.采用Lipof

8、ectamine2000試劑進行瞬時轉染。
　　 6.統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)以均數(shù)±S表示。兩組間差異采用Student’s t test分析。P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果:
　　 一、硼替佐米增強胃癌細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性
　　 1.50ng/mL的TRAIL作用于三種細胞24h后，細胞存活率分別為72.67士4.93％，92.33士5.86％，和98.33士2.31％。延長TRA

9、IL作用時間到48h，或提高TRAIL濃度至1000ng/mL，均不能進一步增強TRAIL的毒性。流式細胞術PI染色結果提示TRAIL作用24h后，三種細胞系中亞二倍體比率不足8％。
　　 2.50nM硼替佐米單獨作用胃癌細胞僅引起輕度細胞死亡。50nM硼替佐米預處理可增強TRAIL對三種胃癌細胞的毒性。在MGC803細胞，聯(lián)合用藥可將細胞活力從70.42士1.14％減低到34.85士2.83％，細胞凋亡從8.22±0.83％增

10、強到31.27士2.02％。類似的協(xié)同作用也見于另兩種細胞系。
　　 3.50nM硼替佐米和50ng/mL TRAIL單獨作用于三種胃癌細胞系，24h后均可見到線粒體跨膜電位的下降。硼替佐米預處理2h后再予TRAIL作用24h，線粒體跨膜電位被進一步降低。在MGC803細胞，TRAIL單獨作用24h可使線粒體跨膜電位下降10.97士4.66％，硼替佐米聯(lián)合TRAIL可使線粒體膜電位下降54.27士7.71％，與TRAIL單藥相比

11、有統(tǒng)計學意義，P＜0.05.在SGC7901，BGC823細胞中，硼替佐米預處理也可進一步增強TRAIL引起的線粒體跨膜電位下降，但是與TRAIL單藥相比無統(tǒng)計學差異。
　　 4.50nM硼替佐米預處理三種細胞系2h后，加入50ng/mL TRAIL繼續(xù)作用12h，三種細胞系中G2/M期細胞比率明顯增加。與TRAIL聯(lián)用并未進一步增加G2/M期阻滯。
　　 5.TRAIL或硼替佐米單獨作用于SGC7901細胞24h均不能

12、誘導caspase8活性片段的產(chǎn)生，但二者聯(lián)用可明顯裂解caspase8，繼而裂解caspase3，同時Caspase3及caspase8前體明顯減少。相似的caspase變化也見于其它兩種胃癌細胞系。硼替佐米聯(lián)合TRAIL對死亡受體DR5，凋亡相關蛋白Bcl-2，Bax的表達無明顯影響，但是可輕度下調(diào)cIAP-1的表達。硼替佐米單藥可明顯上調(diào)Survivin表達，與TRAIL聯(lián)用并未進一步增加表達上調(diào)。
　　 二、TRAIL活

13、化NF-κB通路阻止胃癌細胞凋亡
　　 1.50ng/mL TRAIL處理SGC7901細胞30min后可活化NF-κB，Western blot可檢測到清晰的IκB降解。而TNF可于更早時間激活NF-κB，在處理后15min即可檢測到IκB降解，且其降解程度明顯強于TRAIL誘導的IκB降解。
　　 2.用空載體或編碼磷酸化缺陷突變型HA標記IκB(HA-IκB)的cDNA瞬時轉染8GC7901細胞48h，加入50ng

14、/mL TRAIL繼續(xù)作用24h，轉染空載體的細胞僅7.09±0.84％發(fā)生凋亡，而轉染突變型HA-IκB的細胞中凋亡細胞升至17.80±2.34％，兩組有顯著性差異，P＜0.05。
　　 三、硼替佐米抑制PI3K/Akt通路，逆轉胄癌細胞對TRAIL誘導凋亡的耐藥
　　 1.50ng/mL TRAIL處理SGC7901細胞1h可檢測到Akt的磷酸化，其磷酸化水平隨時間逐漸升高，8h升至最高點，之后逐漸下降，16h后降至

15、基礎水平。
　　 2.50nM硼替佐米預處理SGC7901細胞2h后，再以TRAIL處理8h，磷酸化Akt水平不能被進一步提高，提示硼替佐米抑制了TRAIL引起的PI3K/Akt通路活化。50μM的LY294002預處理細胞1h后，再以TRAIL處理8h，基線水平和TRAIL誘導的Akt磷酸化水平均被有效抑制，且LY294002對TRAIL誘導的Akt磷酸化水平的抑制與硼替佐米相似。
　　 3.TRAIL或LY29400

16、2單獨作用于SGC7901細胞24h后，亞二倍體細胞僅占5％左右，而兩藥聯(lián)合后亞二倍體細胞升至18.38±0.77％，與TRAIL單藥組相比有顯著性差異，P＜0.05。
　　 結論:
　　 1.人胃癌細胞系對TRAIL誘導的凋亡耐藥。
　　 2.亞毒性劑量的硼替佐米可協(xié)同TRAIL抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡。
　　 3.硼替佐米促進caspases裂解，降低線粒體跨膜電位，下調(diào)抗凋亡蛋白cIAP-1，

17、但對Bax，Bcl-2表達水平無明顯影響。
　　 4.硼替佐米單獨或與TRAIL聯(lián)合可引起G2/M期阻滯，同時伴有Survivin表達上調(diào)。
　　 5.TRAIL可活化SGC7901細胞中NF-κB通路，特異性抑制NF-κB活性可部分逆轉細胞對TRAIL誘導凋亡的耐藥，提示在胃癌細胞中NF-κB主要發(fā)揮抗凋亡作用。
　　 6.TRAIL可活化胃癌細胞中PI3K/Akt通路，硼替佐米抑制TRAIL引起的PI3K/A