抗纖軟肝顆粒對肝星狀細胞整合素介導的MAPK信號通路的影響.pdf

1、目的:肝纖維化(liver fibrosi s，LF)為各種慢性肝疾患所導致的一系列損傷一修復，最終肝組織內(nèi)細胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)過度沉積的反應。由于發(fā)生的機制比較復雜，至今對肝纖維化的了解還很有限，因此制約了肝纖維化治療的發(fā)展。肝星狀細胞(Hepatic Stellate cell，HSC)作為 ECM 的主要生成細胞，被認為是各種肝臟損傷引起肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機制中，對肝

2、星狀細胞激活的啟動、維持，細胞外基質(zhì)也起著重要的作用。HSC與ECM之間存在著復雜的相互作用，而其相互作用主要經(jīng)整合素介導。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是整合素信號途徑中連接整合素與下游信號分子的媒介，是胞內(nèi)多個信號途徑的交匯點。其中，以FAK為中心的整合素信號轉(zhuǎn)導通路主要是Ras-MAPK途徑，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellularsignal-regulated kinase，ERK

3、1/2)是MAPK家族中研究最為清楚的成員，其通路Ras-RAF-MEK-ERK參與細胞多種活動?？估w軟肝顆粒組方在臨床上有良好的療效，現(xiàn)將其制成適應臨床需要的顆粒劑。在既往研究的基礎上，應用體外細胞培養(yǎng)技術，從肝星狀細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用著手，以整合素、FAK、ERK1/2為研究切入點，研究抗纖軟肝顆粒對肝星狀細胞整合素信號通路的影響，由此闡釋抗纖軟肝顆?？垢涡菭罴毎鲋撑c誘導凋亡的作用機制。 方法： (1)首先根

4、據(jù)處方中丹參、莪術及鱉甲所含化學成分的理化性質(zhì)及其藥理作用，以提取丹參酮ⅡA和莪術揮發(fā)油為目的，確定抗纖軟肝顆粒的制備制成工藝，用正交設計的直觀分析優(yōu)化幾種輔料的用量確定最終的制劑處方。 (2)考察成品的體外溶出度；同時對之進行全面的質(zhì)量控制研究，制定質(zhì)量標準。 (3)運用體外細胞培養(yǎng)技術，以HSC-T6細胞系為研究對象，分為空白包被+10％生理鹽水血清組、FN包被+10％生理鹽水血清組、FN包被+5％kxr組、FN包被

5、+10％kxr組、FN包被+20％kxr組。按以上分組進行藥物干預，各組FN(3μg/ml)均于kxr加入前30分鐘加入，干預后繼續(xù)培養(yǎng)48h。 (4)采用MTT法測細胞增殖，采用甲苯胺藍染色方法測定細胞黏附率；Annexin V-PE/7-ADD法測定 Hsc凋亡。 (5)應用免疫細胞組織化學方法檢測HSC整合素α5β1蛋白的表達。 (6)應用免疫細胞組織化學方法檢測 HSC FAK 蛋白的表達，采用RT-PC

6、R法測定FAKmRNA的表達。 (7)應用免疫細胞組織化學方法檢測HSC ERK1蛋白的表達，采用RT-PCR法測定ERK1mRNA的表達。 結(jié)果： (1)丹參的滲漉最佳工藝為：用90％的乙醇進行滲漉，流速為0.6ml/min，乙醇用量為12倍，浸泡時間為16h；鱉甲超微粉碎后置顯微鏡下觀察，可見粒徑小于5um的多于50％，粒徑小于10um的多于90％；莪術揮發(fā)油的最佳提取工藝為加水8倍，浸泡時間為0.5h，煎煮

7、5h。莪術揮發(fā)油的最佳包合工藝為揮發(fā)油：β-CD(1：4)，攪拌時間為60min，包合溫度為50℃，以10000r/min的轉(zhuǎn)速進行包合。制備工藝中確定以糊精為輔料，藥物：糊精：1：0.5，以50％乙醇為潤濕劑，加入0.4％倍CMC作為助懸劑，過16目篩制粒，50℃干燥，10目篩整粒。 (2)含量測定方法學考察實驗中，其回收率合格，精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，說明了所制定的含量測定方法的合理性和可行性；樣品在考察期各項指標無明顯

8、變化，均符合規(guī)定。 (3)與FN組比較，kxr各組均可以抑制HSC增殖，存在顯著差異(P<0.01)，kxr各組均可以誘導HSC凋亡，與FN組及空白對照組比較存在顯著差異(P<0.01)，與空白對照組比較，kxr 各組均可以抑制 FN與HSC的粘附，存在顯著差異(P<0.01)。 (4)抗纖軟肝顆粒含藥血清組HSC的整合素α5β1蛋白表達顯著下調(diào)，與空白對照組及FN組相比有顯著性差異(P<0.01)。 (5)抗纖

9、軟肝顆粒含藥血清組HSC的FAKmRNA、蛋白表達均顯著下調(diào)，分別減少了 43.32％(11.93％)，56.52％(39.52％)，70.27％(53.42％)，與對照組及FN組相比，KXR1組(p<0.05)，KXR2組、KXR3組(p<0.01)，均有顯著性差異。 (6)抗纖軟肝顆粒含藥血清組HSC的ERK1mRNA、蛋白表達均顯著下調(diào)，分別減少了 39.53％(8.93％)。47.45％(35.62％)，56.78％(5

10、0.12％)，與對照組及 FN組相比，KXR1組(p<0.05)，KXR2組、KXR3組(p<0.01)，均有顯著性差異。 結(jié)論： (1)所確定的制備工藝穩(wěn)定可行，質(zhì)量控制方法合理可行。 (2)FN 能夠刺激HSC增殖，由此可知細胞外基質(zhì)通過整合素介導對肝星狀細胞激活的啟動、維持起著重要的作用。實驗發(fā)現(xiàn)，抗纖軟肝顆粒含藥血清可以抑制由FN刺激的HSC增殖，并誘導HSC凋亡，并能抑制HSC的粘附，呈劑量依賴關系?？?/p>

11、纖軟肝顆粒能夠下調(diào)HSC整合素α5β1的表達，能夠在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平抑制FAK及ERK1mRNA、蛋白的表達。 (3)抗纖軟肝顆粒含藥血清有較好的抑制HSC增殖，并誘導HSC凋亡的作用，可能是通過以下途徑實現(xiàn)的：抑制或拮抗了細胞外基質(zhì)與其受體整合素的結(jié)合，從而抑制細胞外基質(zhì)與HSC的粘附；通過下調(diào)整合素蛋白的表達，降低下游信號分子FAK及ERK1mRNA、蛋白的表達，阻抑了整合素激活的 FAK 信號途徑中的 Ras 依賴的絲裂原活