甘草酸對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞TGF-β1-smad信號(hào)通路的影響.pdf

1、肝纖維化是多種慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)。肝纖維化發(fā)展的各個(gè)時(shí)期，肝星狀細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的失衡是重要病理機(jī)制。其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF—B1)起了關(guān)鍵作用。TGF-β信號(hào)通過(guò)跨膜絲氨酸／蘇氨酸受體激酶?jìng)鬟f入核，胞漿內(nèi)進(jìn)化保守的smad蛋白家族起了重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。它們主要分為3類(lèi)：受體調(diào)控型smads(R—smads)可直接與活化的I型受體結(jié)合而磷酸化：共同介導(dǎo)型smads(Co—smads)是必需的中轉(zhuǎn)分子，當(dāng)R-sma

2、ds磷酸化并與之形成寡聚體后可轉(zhuǎn)位入核調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄；抑制型smads(I—smads)是TGF—B信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。其中Smad2、3、4、7參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 甘草酸是目前廣泛應(yīng)用于臨床的有效的慢性肝病治療藥物。它可能通過(guò)誘導(dǎo)干擾素Q，抑制白介素6和腫瘤壞死因子表達(dá)，誘生前列腺素E，抑制磷脂酶A2的活性而起作用的。既往研究提示甘草酸可能通過(guò)干預(yù)TGF—β／smad信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗纖維化作用的，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步明確。

3、 目的：研究甘草酸對(duì)TGF—B1刺激的大鼠肝星狀細(xì)胞中TGF—β／smad信號(hào)通路的影響。以期揭示甘草酸抗纖維化的分子機(jī)制。 方法：用SD大鼠分離肝星狀細(xì)胞并體外培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分成對(duì)照組和不同濃度甘草酸給藥組(1umol／卜1000μmol／1)。用MTT法研究對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，臺(tái)盼藍(lán)拒染法和上清液LDH測(cè)定來(lái)研究對(duì)細(xì)胞活力的影響。ELISA法測(cè)定上清中HSC分泌的TGF-Bl。Westernblot法檢測(cè)α．SMA蛋白質(zhì)表達(dá)水

4、平。采用GEArray基因芯片檢測(cè)對(duì)照組，TGF—B1組，TGF-β1+甘草酸100μmol／L組的基因表達(dá)，篩選與TGF-B／smad通路相關(guān)的有變化意義的靶基因。然后分成6組，分別為對(duì)照組、TGF-B1組、TGF-Bl+不同濃度甘草酸組(1umol／l一1000umol／1)。采用半定量RT-PCR法檢測(cè)smad2、smad3、smad?、Q2I型前膠原、QlIII型前膠原、纖溶酶原激活物抑制因子一1、TGFβ2型受體mRNA水平，

5、采用Westernblot法檢測(cè)smad2、磷酸化-smad2、smad3、胞核-smad3、smad?、I型膠原、III型膠原、纖溶酶原激活物抑制因子一1和TGFβ2型受體蛋白質(zhì)表達(dá)水平。 結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)顯示100umol／L一1000umol／L甘草酸能明顯抑制肝星狀細(xì)胞增殖但不同濃度甘草酸并不影響肝星狀細(xì)胞的活力。不同濃度甘草酸能逐漸抑制α-SMA蛋白質(zhì)表達(dá)水平。1000μmol／L甘草酸能抑制上清液中肝星狀細(xì)胞分泌的T

6、GF-β1?；蛐酒Y(jié)果表明：經(jīng)TGFB1作用后表達(dá)上調(diào)，再經(jīng)甘草酸作用后表達(dá)下調(diào)的基因有16項(xiàng)；經(jīng)TGFβ1作用后表達(dá)下調(diào)，再經(jīng)甘草酸作用后表達(dá)上調(diào)的基因有5項(xiàng)；經(jīng)TGFβ1作用后表達(dá)上調(diào)，再經(jīng)甘草酸作用后表達(dá)上調(diào)更加明顯的基因有2項(xiàng)。其中有7項(xiàng)基因與TGF—B／smad通路相關(guān)。RTR-PCR和Westernblot結(jié)果驗(yàn)證了與基因芯片的一致性。表明TGF—B1能增加smad2、smad3、smad7、Q2I型前膠原、Q1III型前

7、膠原、纖溶酶原激活物抑制因子一1、TGFB2型受體mRNA表達(dá)水平，同樣增加smad2，磷酸化-smad2、smad3、胞核一smad3、smad7、I型膠原、III型膠原、纖溶酶原激活物抑制因子一1、TGFB2型受體蛋白質(zhì)表達(dá)。lumol／卜1000umol／1甘草酸能逐漸降低smad2、smad3、smad7、I型膠原、III型膠原、纖溶酶原激活物抑制因子一l的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，但增加TGFB2型受體的mRNA水平和蛋白質(zhì)表

8、達(dá)。 結(jié)論：高濃度甘草酸能抑制肝星狀細(xì)胞增殖和TGF-β分泌；不同濃度的甘草酸能減少smad2、smad3、smad7、I型膠原、III型膠原、纖溶酶原激活物抑制因子一1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，但上調(diào)TGFβ2型受體mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactorbetaTGFβ)是一類(lèi)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的多肽，具備多種生物學(xué)作用。在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有活化肝星狀細(xì)胞(hepa

9、tocelluarstellatecellHSC)、促進(jìn)膠原基因表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成與沉積等作用，是最重要的促肝纖維化細(xì)胞因子之一。大量研究證實(shí)TGFB／Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是TGFB發(fā)揮生物學(xué)作用的主要通路，其分子組成與分子調(diào)節(jié)復(fù)雜，與其它信號(hào)通路存在廣泛的交互影響，對(duì)不同的組織細(xì)胞及肝纖維化的不同病程的作用均有明顯的差異。對(duì)TGFβ／Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的深入研究不僅使肝纖維化的發(fā)病機(jī)制得到進(jìn)一步的闡明，也給肝纖維化的防治研究提