神經修復對產癱近端神經元影響機制的實驗研究.pdf

1、第一部分幼年大鼠神經根斷裂后移植修復對神經元存活影響的研究 目的 研究幼年大鼠臂叢神經根損傷后早期神經移植手術對脊髓前角運動神經元和背根神經節(jié)感覺神經元存活的影響，探討早期臂叢修復對產癱近端神經元影響作用的形態(tài)學基礎。 方法 取SPF級Sprague-Dawley幼年大鼠(生后18天，下同)24只，等分為2組：神經根切斷組和神經根修復組。采用TrueBlue注射法逆行標記近端神經元。神經根切斷組將右側頸5

2、神經根切除0．3cm；神經根修復組將頸5切除一段后即取自體腓腸神經行移植修復(0．3cmx3股)。術后4周取頸5脊髓前角和背根神經節(jié)，應用TUNEL法檢測凋亡的運動及感覺神經元，比較兩組近端神經元及凋亡細胞數(shù)量的差異。 結果 術后4周，神經根修復組及切斷組脊髓前角TrueBlue標記的運動神經元分別為1495~645．1和656~160．6個，背根神經節(jié)中TrueBlue標記的感覺神經元分別為3415~1251．9和40

3、6~190．4個。神經根修復組運動和感覺神經元數(shù)量明顯多于神經根切斷組，兩組差異有統(tǒng)計學意義(運動神經元f值為3．09，P<0．05；感覺神經元f值為5．82，P<0．01)。 TUNEL檢測結果顯示術后4周兩組大鼠近端神經元均存在不同程度的凋亡。神經根修復組及切斷組脊髓前角運動神經元凋亡細胞分別為85~3．9和136~44．2個，背根神經節(jié)感覺神經元凋亡細胞分別為345~113．4和618~87．0個。神經根修復組運動和感覺神

4、經元凋亡細胞明顯少于神經根切斷組，兩組差異有統(tǒng)計學意義(運動神經元t值為2．79，P<0．05；感覺神經元t值為4．68，P<0．01)。 結論 幼年大鼠神經根損傷后即行修復手術可明顯減少近端運動和感覺神經元死亡，提示早期臂叢修復對產癱近端神經元有保護作用。 第二部分幼年大鼠神經根斷裂后移植修復對神經元影響機制的研究 目的 觀察幼年大鼠神經根損傷后即行神經移植手術對神經元退變程摩、神經營養(yǎng)因子及其

5、受體數(shù)量的影響，從細胞水平探索早期臂叢修復對產癱近端神經元的保護機制。 方法 取SPF級Sprague-Dawley幼年大鼠36只，等分為2組：神經根切斷組和神經根修復組。神經根切斷組將右側頸5神經根切除0．3cm；神經根修復組將頸5切除一段后即取自體腓腸神經行移植修復(0．3cmx3股)。術后4周取頸5脊髓前角和背根神經節(jié)，行酶組織化學染色分析神經元膽堿酯酶(CHE)和酸性磷酸酶(ACP)陽性顆粒的平均灰度及面積百分率

6、，行免疫組織化學染色檢測神經元中膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(GDNF)及其受體GFRal免疫陽性顆粒的數(shù)量，并比較兩組間的差異。 結果 術后4周，神經根修復組及切斷組運動神經元CHE陽性顆粒平均灰度分別為29．1±4．21和23．5±4．60，面積百分率分別為46,4±3．45％和41．5±3．03％；感覺神經元CHE陽性顆粒平均灰度分別為43．3±3．04和34．8±2．40，面積百分率分別為68．6±3．86％和53．

7、9±2．56％。神經根修復組運動和感覺神經元CHE陽性顆粒平均灰度及面積百分率均高于神經根切斷組，兩組差異有統(tǒng)計學意義(運動神經元兩指標t值分別為2．23和2．60，P均<0．05；感覺神經元兩指標f值分別為5．40和5．53，P均<0．01)。 神經根修復組及切斷組運動神經元ACP陽性顆粒平均灰度分別為41．5±3．51和52．4±6．08，面積百分率分別為¨5．5±9．74％和135．9±7．88％；感覺神經元ACP陽性顆粒

8、平均灰度分別為55．0±2．19和60．9±2．74，面積百分率分別為162．1±19．65％和255．5±36．41％。神經根修復組運動和感覺神經元ACP陽性顆粒平均灰度及面積百分率均低于神經根切斷組，兩組差異有統(tǒng)計學意義(運動神經元兩指標f值分別為3．79和3．98，P均<0．05；感覺神經元兩指標f值分別為4．15和5．53，P均<0．01)。 免疫組織化學檢測顯示神經根修復組運動和感覺神經元GDNF免疫陽性顆粒數(shù)目分別為

9、786．3~176．84和2997．0~357．99個，神經根切斷組運動和感覺神經元陽性顆粒數(shù)目分別為335．0~49．50和1632．0~305．55個，兩組差異有高度統(tǒng)計學意義(運動和感覺神經元t值分別為6．02和7．10，P均<0．01)。 神經根修復組運動和感覺神經元GFRal免疫陽性顆粒數(shù)目分別787．5+178．55和3¨1．0~445．72個，神經根切斷組運動和感覺神經元陽性顆粒數(shù)目分別為397．3~41．78和1

10、588．3~229．00個，兩組差異有高度統(tǒng)計學意義(運動和感覺神經元t值分別為5．21和7．44，P均<0．01)。 結論 幼年大鼠早期神經根修復對近端神經元的保護作用與神經元退變程度減輕、代謝功能改善、GDNF及其受體GFRal數(shù)量增加有關。 第三部分幼年大鼠神經根斷裂后移植修復對神經元凋亡基因表達影響的研究 目的 觀察幼年大鼠神經根損傷后即行神經移植修復對近端神經元C-Jun和Bcl-2表達

11、水平的影響，從分子水平探討早期臂叢修復手術對產癱近端神經元保護作用的原因。 方法 取SPF級Sprague-Dawley幼年大鼠12只，等分為2組：神經根切斷組、神經根修復組。神經根切斷組將右側頸5神經根切除0．3cm；神經根修復組將頸5切除一段后即取自體腓腸神經行移植修復(0．3cmx3股)。術后4周取頸5脊髓前角和背根神經節(jié)，通過實時定量逆轉錄一聚合酶鏈式反應(RealTimeRT-PCR)檢測大鼠近端神經元C-Ju

12、n、Bcl-2mRNA的表達水平，并比較兩組間的差異。 結果 術后4周，實時定量RT-PCR檢測顯示神經根修復組脊髓前角運動神經元和背根神經節(jié)感覺神經元C-JunmRNA的表達量分別為7．8+2．32和4．5~1．05copies，神經根切斷組運動和感覺神經元C-JunmRNA的表達量分別為34．2~9．15和7．0~1．10copies，兩組差異有高度統(tǒng)計學意義(運動和感覺神經元t值分別為6．83和4．04，P均<0．

13、01)。 神經根修復組運動和感覺神經元Bcl-2mRNA的表達量分別1252．3~66．31和725．5~100．27copies，神經根切斷組運動和感覺神經元Bcl-2mRNA的表達量分別843．3士162．46和433．3~98．93copies，兩組差異有高度統(tǒng)計學意義(運動和感覺神經元t值分別為5．71和5．08，尸均<0．01)。 結論 幼年大鼠經早期神經根修復后其近端神經元C-Jun表達量增加、Bcl

14、-2表達量減少，表明凋亡基因表達水平變化是早期臂叢修復手術保護近端神經元的分子機制。 第四部分幼年大鼠神經根斷裂后不同時間的移植修復對神經元影響的研究 目的 研究幼年大鼠神經根切斷后不同時間的神經移植修復對近端感覺及運動神經元存活數(shù)量的影響，為臨床上確立產癱的最佳手術時機提供相關實驗基礎。 方法 取SPF級Sprague-Dawley幼年大鼠48只，隨機等分為8組。一組為單純切斷組，余7組分別為：

15、立即修復組和3、6、9、12、15、18天修復組。采用TrueBlue注射法逆行標記神經元。單純切斷組將右側頸5神經根切除0．3cm；立即修復組將頸5切除一段后即取自體腓腸神經行移植修復(0．3cmx3股)。其余各組分別在頸5切斷后間隔相應時間修復神經根。術后4周取頸5脊髓前角和背根神經節(jié)，比較各組運動和感覺神經元存活的數(shù)量。 結果 幼年大鼠頸5切斷后，3、6天修復組與立即修復組近端神經元計數(shù)結果的差異無統(tǒng)計學意義(P均

16、>0．05)，上述三組神經元數(shù)量較單純切斷組顯著增多(P均<0．05)。與立即修復組相比，9天修復組近端感覺神經元數(shù)量明顯減少(P<0．05)，但運動神經元數(shù)量無顯著差異(P>0．05)。單純切斷組和15、18天修復組近端神經元數(shù)量的差異無統(tǒng)計學意義(P均>0．05)。 結論 幼年大鼠神經根損傷后，在O～9天(相當于人類0～6個月)內修復對近端神經元可產生較滿意的保護作用，且呈越早手術療效越顯著的趨勢。這提示臨床上對有手