肺炎克雷伯菌的分子流行病學(xué)及分子耐藥機(jī)制研究.pdf

1、背景:肺炎克雷伯菌是一種重要的條件致病菌，感染肺炎克雷伯菌可導(dǎo)致敗血癥，肺炎，尿路感染以及軟組織損傷等一系列嚴(yán)重的疾病。近年來(lái)，隨著耐藥肺炎克雷伯菌的廣泛傳播，其已經(jīng)成為醫(yī)院感染最重要的病原菌之一。本文目的是研究臨床肺炎克雷伯菌的耐藥表型特點(diǎn)、相關(guān)耐藥基因存在情況、尋找新耐藥分子機(jī)制以及研究耐藥基因的傳播特征。
　　 方法:2010年11月1日至2011年10月31日，從北京306醫(yī)院收集臨床敏感以及耐藥肺炎克雷伯菌株。經(jīng)過(guò)表型

2、鑒定以及16SrDNA測(cè)序確認(rèn)，使用VITEK2系統(tǒng)檢測(cè)所收集菌株的耐藥表型，ESBL陽(yáng)性株的確定是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的NCCLS操作流程驗(yàn)證進(jìn)行。我們?cè)O(shè)計(jì)了31對(duì)有代表性的引物對(duì)多耐藥菌株中的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)全面比較耐藥表型與耐藥基因間的相關(guān)性，探索基于耐藥基因分析的分子方法在臨床耐藥肺炎克雷伯菌早期檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用構(gòu)建Fosmid文庫(kù)和亞克隆的策略探尋和確證臨床肺炎克雷伯菌中新的耐藥基因和耐藥機(jī)制，從而為建立更全面而準(zhǔn)確的肺炎克

3、雷伯菌分子耐藥檢測(cè)法以及研制更高效特異的抗耐藥肺炎克雷伯菌的藥物提供新的靶點(diǎn)信息。為了解耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移情況，選取了12株有代表性的多耐藥菌株，進(jìn)行了接合試驗(yàn)并對(duì)其整合子Ⅰ性進(jìn)行了分析，并用PFGE進(jìn)行基因分型分析。
　　 結(jié)果:所收集的248株臨床肺炎克雷伯菌，經(jīng)確證肺炎克雷伯菌株有223株，其中137株屬于MDR，49株屬于XDR，4株屬于PDR，33株屬于其他耐藥類型。101株為ESBL陽(yáng)性。對(duì)青霉素類(penicill

4、ins)抗生素的耐藥率(99.6％)最高，其次是硝基呋喃類(Nitrofurantoin)抗生素，耐藥率為(85.2％)。對(duì)碳青霉烯類(Carbapenems)抗生素耐藥率(7.2％)最低，其次是青霉素/B-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物（Penicillins+b-lactamaseinhibitors）耐藥率為(22.4％)。檢測(cè)耐藥菌株耐藥基因存在情況，結(jié)果顯示菌株的某些耐藥表型和所含有的耐藥基因高度相關(guān)而另一些耐藥表型與已知的耐藥基因的相

5、關(guān)性不高，位于質(zhì)粒上的一些基因例如qnr大量存在，致使耐藥基因在菌株之間傳遞的可能性加大。對(duì)其中的ESBL+和ESBL-菌株進(jìn)行比對(duì)，前者攜帶更多的耐藥相關(guān)基因。通過(guò)構(gòu)建Fosmid文庫(kù)和亞克隆策略在TZS-KP-9菌株中初步篩選到新的潛在耐藥基因。對(duì)12株多耐藥菌株的接合試驗(yàn)結(jié)果顯示，接合子受體菌對(duì)青霉素類(penicillins)、廣譜頭子包類(Extended-spectrum，cephalosporins;3rdand4thge

6、nerationcephalosporins)、單環(huán)內(nèi)酰胺類(Monobactams)以及葉酸代謝途徑抑制劑(Folatepathwayinhibitors)的MIC都有較大提高，相關(guān)耐藥基因也同樣被檢出。對(duì)整合子Ⅰ型的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中有4株菌檢測(cè)到了整合子Ⅰ型的基因盒，并對(duì)其中所含的基因進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了很多已知的耐藥基因，例如aadA1、aadA2、aac(6')-Ib、aar-3、dfrA12和dfrA15，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了假想蛋白，其

7、與耐藥的相關(guān)性正在進(jìn)一步的深入研究中。PFGE分析結(jié)果表明，12株菌中其中4株有共同的基因型，提示某些高度耐藥菌在住院病人之間存在傳播。
　　 結(jié)論:肺炎克雷伯菌對(duì)除外碳青酶烯類抗生素之外的其它臨床常用抗菌藥物的耐藥率均較高，多重耐藥現(xiàn)象比較普遍。TZS-KP-9菌株含有新的潛在耐藥基因，顯示出對(duì)于目前未知的耐藥基因/基因亞型和新的耐藥機(jī)制仍需要不斷探究。綜合耐藥相關(guān)基因存在情況、接合實(shí)驗(yàn)及對(duì)整合子Ⅰ型的研究表明，耐藥基因隨著質(zhì)