人PCNA泛素化修飾在順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、細(xì)胞在多種內(nèi)外環(huán)境及化學(xué)物質(zhì)不斷攻擊下會(huì)誘發(fā)DNA損傷。細(xì)胞首先通過DNA損傷檢查點(diǎn)，啟動(dòng)細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)一步實(shí)施DNA修復(fù)或細(xì)胞凋亡。 增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)是一種表達(dá)水平隨細(xì)胞周期波動(dòng)高度保守的生長(zhǎng)調(diào)控蛋白，可圍繞DNA鏈組裝成三聚體滑動(dòng)夾，是DNA聚合酶(polymerase，pol)polδ和polε的輔助因子。 近年來(lái)，大量研究表明蛋白質(zhì)的多種

2、翻譯后修飾可參與調(diào)控蛋白質(zhì)的生理活動(dòng)，PCNA作為2002年第一個(gè)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)非經(jīng)典泛素化途徑(不引起蛋白的降解)修飾的蛋白，其泛素化修飾的研究一直是一個(gè)熱點(diǎn)。研究表明，在DNA損傷條件下，PCNAK164位點(diǎn)可發(fā)生泛素化。 在眾多外源性DNA損傷因素中，以紫外(UV)和順鉑(cisplatin)研究的最多。紫外照射主要形成干擾DNA復(fù)制的環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)和6-4光產(chǎn)物，主要通過核苷酸切除(NucleotideExcis

3、ionRepair,NER)過程進(jìn)行DNA修復(fù)；順鉑作為臨床上常用的化療藥物，其主要是通過形成鉑-DNA加合物并造成DNA鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián)阻滯DNA復(fù)制，其修復(fù)途徑除了NER外，還涉及錯(cuò)配修復(fù)、同源重組等。目前有關(guān)PCNA泛素化的研究多采用紫外線照射損傷為模型，且大多集中于探討PCNA泛素化在募集錯(cuò)配傾向DNA聚合酶及在跨損傷復(fù)制中的作用。由于UV與順鉑損傷的作用機(jī)理有一定的相似性，那么PCNA泛素化修飾是否在順鉑所誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答中

4、也發(fā)揮了重要的作用，或者這種應(yīng)激反應(yīng)只具有DNA損傷類型的特異性?PCNA泛素化在DNA誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)是否僅限于啟動(dòng)跨損傷復(fù)制和復(fù)制后修復(fù)?在其它應(yīng)激反應(yīng)中，如細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡或DNA修復(fù)過程是否同樣也發(fā)揮著協(xié)同或拮抗作用?我們選用了損傷應(yīng)答過程更為復(fù)雜的順鉑作為DNA損傷因素。另一方面，作為常規(guī)化療藥物，選擇順鉑損傷開展研究，有助于進(jìn)一步深入了解順鉑耐藥性及誘導(dǎo)高突變產(chǎn)生等機(jī)制，從而具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 基于以上分析

5、，本課題主要圍繞PCNA泛素化修飾與順鉑損傷應(yīng)答相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究.本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步闡明PCNA泛素化修飾在DNA損傷應(yīng)答中重要的生物學(xué)作用提供重要的研究線索。 方法： 1.重組人PCNA及其突變體mutantPCNA(mPCNA)真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定：以質(zhì)粒pTAP-PCNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到人PCNA的相應(yīng)序列。將該序列片斷克隆至pGEM-TEasy載體中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，獲得重組質(zhì)粒pGEM-TE

6、asyPCNA，回收PCNA目的片斷。以測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEM-TEasyPCNA為模板采用一步反向PCR致突變法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增、連接，并經(jīng)雙酶切回收mutantPCNA目的片段，行序列測(cè)定。 2.PCNA及其突變體mPCNA穩(wěn)定高表達(dá)Hela細(xì)胞系的建立 2.1 PCNA及mPCNA真核表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞：將Hela細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種于35mm培養(yǎng)板中，24小時(shí)貼壁后，參照l(shuí)ipofectamin

7、eTM2000脂質(zhì)體操作說明，將lipofectamineTM2000-DNA復(fù)合物加入培養(yǎng)板中，進(jìn)行穩(wěn)定篩選。 2.2 順鉑誘導(dǎo)PCNA泛素化修飾的檢測(cè)：將穩(wěn)定高表達(dá)PCNA及mPCNA的Hela細(xì)胞消化鋪板，24小時(shí)貼壁后，加入順鉑使終濃度為15μmol/L，藥物作用4小時(shí)后，PBS洗3遍，加入不含藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，收取細(xì)胞全蛋白，以鼠抗人his抗體為一抗，以標(biāo)記了HRP的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行westernbl

8、ot方法顯色分析。 3.PCNA泛素化修飾對(duì)細(xì)胞順鉑敏感性及細(xì)胞凋亡的影響 3.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞順鉑敏感性：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型Hela細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PCNA、mPCNA的Hela細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后以適當(dāng)濃度接種于96孔板中，第二天貼壁后，加入不同濃度的順鉑(5個(gè)復(fù)孔)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組及試驗(yàn)組。藥物作用4小時(shí)后，PBS洗三遍，換入不含藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24小時(shí)后，加入MTT(5mg/ml)20ul/孔。培養(yǎng)4小時(shí)后

9、，翻板法倒盡板內(nèi)液體，每孔再加入150ulDMSO，充分混勻，492nm測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞的存活率：實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100％。 3.2克隆形成法檢測(cè)細(xì)胞順鉑敏感性：將野生型Hela細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PCNA、mPCNA的Hela細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后以1000個(gè)/孔的密度接種于6孔板中。第二天貼壁后，加入不同濃度的順鉑，作用4小時(shí)后，PBS洗三遍，換入不含藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)約2周，直到長(zhǎng)出肉眼可見克隆時(shí)，用PBS洗兩遍，再

10、用無(wú)水甲醇固定15分鐘，棄去，姬姆薩染色20min，計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，并計(jì)算克隆形成率。克隆形成率(％)=克隆數(shù)/接種數(shù)×100％。 3.3細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：將野生型Hela細(xì)胞及穩(wěn)定高表達(dá)mPCNA的Hela細(xì)胞消化鋪板，24小時(shí)貼壁后，加入順鉑使終濃度分別為15μmol/L和20μmol/L，藥物作用4小時(shí)后，PBS洗3遍，再加入不含藥物的培養(yǎng)基分別作用12h和24h后收取細(xì)胞。AnnexinV-FITC和PI雙染法

11、檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡。 4.PCNA泛素化修飾對(duì)DNA損傷修復(fù)能力的影響：用順鉑在體外將PUG15-Luc質(zhì)粒進(jìn)行損傷，劑量為100μmol/L，時(shí)間為4h，重新將質(zhì)粒進(jìn)行提取和純化。損傷后的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入野生型Hela細(xì)胞及穩(wěn)定高表達(dá)PCNA及mPCNA的Hela細(xì)胞，以未損傷的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)使質(zhì)粒得以充分修復(fù)和表達(dá)。48h后裂解細(xì)胞，檢測(cè)Luciferase報(bào)告基因的表達(dá)，并計(jì)算相對(duì)損傷修復(fù)率(％)=損傷質(zhì)粒LucRL

12、U值/未損傷質(zhì)粒LucRLU值×100％。 5.PCNA泛素化修飾對(duì)DNA損傷后細(xì)胞周期阻滯的影響：將野生型Hela細(xì)胞及穩(wěn)定高表達(dá)mPCNA的Hela細(xì)胞消化鋪板，24小時(shí)貼壁后，加入順鉑使終濃度為15μmol/L，藥物作用4小時(shí)后，PBS洗3遍，再加入不含藥物的培養(yǎng)基分別作用：12h、24h、36h，后收集細(xì)胞流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)分析。 6.PCNA泛素化修飾對(duì)順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的的基因突變作用機(jī)制的研究：用順鉑在

13、體外將含有SupF報(bào)告基因的穿梭質(zhì)粒。PSupFG1進(jìn)行損傷，將損傷后的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入野生型Hela細(xì)胞及穩(wěn)定高表達(dá)mPCNA的Hela細(xì)胞；繼續(xù)培養(yǎng)使質(zhì)粒得以充分修復(fù)和復(fù)制。48小時(shí)后，提取細(xì)胞內(nèi)的supF質(zhì)粒，用DpnI酶切三個(gè)小時(shí)，然后將其電轉(zhuǎn)入SY204細(xì)菌；將細(xì)菌鋪板在含有X-gal、IPTG和氨芐青霉素的平板上，長(zhǎng)出藍(lán)白斑，根據(jù)藍(lán)白斑數(shù)量計(jì)算突變頻率(％)=白色菌落/白色菌落+藍(lán)色菌落x100％。 結(jié)果： 1

14、.真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1/V5-HisA-PCNA和pCDNA3.1/V5-HisA-mPCNA經(jīng)酶切、測(cè)序分析與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的序列完全一致。表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后，westernblot結(jié)果顯示在相應(yīng)位置可見清楚的目的條帶。 2.提取野生型及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PCNA和mPCNA的Hela細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE及westernblot分析. 3.MTT法：不同濃度順鉑作用后，野生型及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PCNA的Hela細(xì)胞

15、存活率從100％降到約82％，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mPCNA的Hela細(xì)胞存活率從100％降到23％，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。 4.根據(jù)Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算出DNA的相對(duì)損傷修復(fù)率。野生型Hela:25％，Hela-PCNA:22％，Hela-mPCNA:23％。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Hela-mPCNA細(xì)胞與對(duì)照組相比損傷修復(fù)率沒有顯著差異。 5.細(xì)胞周期：與未處理的細(xì)胞(s:31％，24h)相比，順鉑處理后，野生型Hel

16、a細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的s期阻滯(P＜0.05)，在24h達(dá)到59％，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mPCNA的Hela細(xì)胞(S:33％，24h)幾乎沒有S期的阻滯。 6.將PSupFGl質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入野生型及穩(wěn)定高表達(dá)PCNA及mPCNA的Hela細(xì)胞，提取出細(xì)胞內(nèi)PSupFG1質(zhì)粒，然后高效的將其轉(zhuǎn)入SY204細(xì)菌，最后鋪板數(shù)出藍(lán)白斑得出突變頻率：WT-Hela:2.58‰；PCNA-Hela:2.54‰；mPCNA-Hela:0.57‰。與對(duì)照組相比

17、，穩(wěn)定高表達(dá)mPCNA的Hela細(xì)胞其SupF基因突變率明顯降低。 結(jié)論： 1.成功建立了拮抗性抑制PCNA泛素化修飾的細(xì)胞模型。 2.PCNA泛素化修飾參與調(diào)控順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡性死亡，從而影響細(xì)胞順鉑敏感性。 3.PCNA泛素化修飾對(duì)順鉑誘導(dǎo)的DNA的損傷修復(fù)能力沒有顯著影響。 4.PCNA泛素化修飾可促進(jìn)DNA損傷后在S期的細(xì)胞周期阻滯。 5.PCNA泛素化修飾在順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA