MicroRNA-106b在喉癌中對(duì)RUNX3表達(dá)的調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其全世界發(fā)病率呈逐年增長趨勢。目前喉癌的治療方法主要是手術(shù)治療，雖然人們一直致力于對(duì)喉癌早診斷、早治療，并在切除癌腫的前提下，盡可能保留或重建喉的功能，但是，患者術(shù)后仍有不同程度發(fā)音障礙和吞咽困難，影響到患者生存質(zhì)量。為了改善療效及提高預(yù)后的生存率，盡管人們不斷探索喉癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，但喉癌發(fā)生的分子機(jī)制尚不明確。
　　microRNA(miRNA)是一類存在于生物體內(nèi)非編碼單鏈小分子RNA，長度約

2、為21～25個(gè)核苷酸，它們通過堿基互補(bǔ)配對(duì)方式與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-untranslatedregion，3'UTR)完全或不完全結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或翻譯抑制，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。目前研究認(rèn)為，miRNA通過類似癌基因、抑癌基因或其他方式的作用對(duì)細(xì)胞生長、凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展。我們前期通過miRNA芯片技術(shù)篩選到了一系列在喉癌中表達(dá)差異的miRNA，如：miR-106b、miR-151-3p、

3、miR-19b、miR-185、miR-139-5p等。后期我們通過熒光定量PCR進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-106b在喉癌中顯著性表達(dá)，因此，本研究以miR-106b為研究對(duì)象，揭示其在喉癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　第一部分miR-106b在喉癌組織中的表達(dá)研究
　　目的
　　研究miR-106b在喉癌、癌旁組織中表達(dá)水平。
　　方法
　　提取14例配對(duì)喉癌手術(shù)新鮮標(biāo)本(喉癌組織和癌旁組織)RNA，用莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光

4、定量PCR法檢測miR-106b在喉癌和癌旁組織中表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　喉癌組織中miR-106b表達(dá)水平較癌旁組織顯著增高。
　　結(jié)論
　　miR-106b在喉癌組織中高表達(dá)，推測miR-106b可能與喉癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　第二部分miR．106b對(duì)喉癌細(xì)胞增殖、侵襲和體內(nèi)生長能力的影響
　　目的
　　研究miR-106b對(duì)喉癌細(xì)胞體外增殖、侵襲和體內(nèi)生長能力的影響。
　　方法

5、r>　　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-106bASO后，Hep-2和TU-212喉癌細(xì)胞miR-106b表達(dá)水平，采用體外克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)生長實(shí)驗(yàn)觀察miR-106b對(duì)Hep-2和TU-212喉癌細(xì)胞增殖和侵襲能力影響。
　　結(jié)果
　　轉(zhuǎn)染了miR-106bASO的Hep-2和TU-212喉癌細(xì)胞其miR-106b表達(dá)水平降低了約80％，抑制miR-106b表達(dá)可以降低喉癌細(xì)胞體內(nèi)外生長和體外侵襲能力

6、。
　　結(jié)論
　　miR-106b在喉癌細(xì)胞株中高表達(dá)，而抑制其表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)喉癌細(xì)胞體內(nèi)外生長和體外侵襲能力。
　　第三部分miR-106b靶向調(diào)控RUNX3的研究
　　目的
　　研究miR-106b是否可以直接靶向調(diào)控RUNX3。
　　方法
　　生物信息學(xué)方法篩選RUNX3的候選miRNA，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測候選miRNA對(duì)RUNX3的調(diào)控作用，Westernblot檢測轉(zhuǎn)染了miR

7、-106b模擬劑和抑制劑的喉癌細(xì)胞中RUNX3蛋白表達(dá)變化，采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-106b對(duì)RUNX3直接調(diào)控作用。
　　結(jié)果
　　預(yù)測的RUNX3上游的11個(gè)可能調(diào)控性miRNA，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示共轉(zhuǎn)染miR-130b、miR-106bmimics和RUNX3-3'UTR能夠顯著降低報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶的活性，其中miR-130b能夠直接靶定RUNX3在胃癌細(xì)胞中已有報(bào)導(dǎo)。因此，我們進(jìn)一步研究miR-10

8、6b的作用。轉(zhuǎn)染miR-106bASO的喉癌細(xì)胞中RUNX3蛋白表達(dá)水平升高2～3倍，轉(zhuǎn)染miR-106bmimics的喉癌細(xì)胞中RUNX3蛋白表達(dá)水平降低約40%～70%。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-106b功能被ASO減弱后，含有野生型RUNX3-3'UTR報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性顯著增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染miR-106bmimics后，報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性顯著降低，而miR-106bmimics和miR-106bASO對(duì)含有突變型RUNX3-

9、3'UTR的報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性則無顯著影響。
　　結(jié)論
　　RUNX3為miR-106b的靶基因。
　　第四部分喉癌中miR-106b靶向調(diào)控RUNX3作用機(jī)制研究
　　實(shí)驗(yàn)一喉癌中RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化及其蛋白表達(dá)的研究
　　目的
　　研究RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及其蛋白表達(dá)與喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。
　　方法
　　采用Westernblot檢測RUNX3在喉癌組織中的表達(dá)水平

10、。用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生狀況。用WesternBlot檢測RUNX3蛋白在RUNX3啟動(dòng)子甲基化喉癌組織、RUNX3啟動(dòng)子非甲基化喉癌組織和正常喉上皮中的表達(dá)情況。免疫組化檢測正常喉上皮組織、癌旁組織、RUNX3啟動(dòng)子甲基化喉癌組織和RUNX3啟動(dòng)子非甲基化喉癌組織中RUNX3的表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　RUNX3啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率約為41.67%，無論RUNX3啟動(dòng)子是否發(fā)生甲

11、基化，RUNX3在喉癌組織中均低表達(dá)。
　　結(jié)論
　　除RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化在喉癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用外，可能還有其它機(jī)制如miR-106b的調(diào)控引起喉癌的發(fā)生發(fā)展。
　　實(shí)驗(yàn)二研究RUNX3在喉癌細(xì)胞中的作用
　　目的
　　過表達(dá)RUNX3，研究RUNX3在喉癌細(xì)胞中的作用
　　方法
　　構(gòu)建過表達(dá)RUNX3的pCMV6/RUNX3，Westernblot檢測pCMV6/RUNX3質(zhì)粒轉(zhuǎn)

12、染Hep-2和TU-212喉癌細(xì)胞后RUNX3蛋白表達(dá)水平，MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察pCMV6/RUNX3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后生長曲線、增殖和侵襲能力變化。
　　結(jié)果
　　過表達(dá)RUNX3后，喉癌細(xì)胞生長侵襲能力明顯下降。
　　結(jié)論
　　上調(diào)RUNX3表達(dá)可以抑制喉癌細(xì)胞的生長、增殖和侵襲能力。
　　實(shí)驗(yàn)三miR-106b靶向調(diào)控RUNX3在喉癌細(xì)胞中作用機(jī)制
　　目的

13、>　　研究miR-106b通過靶向調(diào)控RUNX3對(duì)喉癌細(xì)胞功能的影響。
　　方法
　　向喉癌細(xì)胞株中同時(shí)轉(zhuǎn)染RUNX3-siRNA和ASO-miR-106b，使得miR-106b和RUNX3的表達(dá)同時(shí)下調(diào)，WesternBlot檢測RUNX3表達(dá)水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測miR-106b表達(dá)水平，克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖和侵襲能力變化。
　　結(jié)果
　　喉癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染ASO-miR-1