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文檔簡介
1、[目的]:
轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的顯著特點(diǎn),也是造成結(jié)直腸癌(colorectalcancer,CRC)患者臨床治療失敗的主要原因。雖然,近年來在結(jié)腸癌的診斷和治療模式上取得了可喜的進(jìn)展,但結(jié)直腸癌的5年生存率仍徘徊在40%左右,仍有近50%的患者死于腫瘤進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。如何預(yù)防及有效治療遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,仍然是目前最值得臨床關(guān)注的問題之一。microRNAs(miRNAs)是一類非編碼的單鏈小RNA,可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種基因的表達(dá),故
2、可調(diào)控細(xì)胞多種生物學(xué)功能。研究表明,許多miRNAs參與了人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,作為癌基因或抑癌基因而發(fā)揮多種生物學(xué)功能。而作為內(nèi)源性小分子,以miRNAs為基礎(chǔ)的針對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)防及治療具有更高的穩(wěn)定性和組織相容度,更低的毒副作用,可能成為新的治療策略。我們希望通過本研究,探討miR-106a在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移侵襲過程中的調(diào)控作用,并以此為基礎(chǔ)尋找抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的新型靶點(diǎn),為腫瘤治療提供新的路徑。
[材料與方法]:
(1
3、)RealtimeRT-PCR的方法檢測(cè)miR-106a在50例結(jié)腸癌組織以及5種結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT29,SW620,LOVO,SW1116,W480)與永生化腸上皮細(xì)胞NCM460中的表達(dá),并進(jìn)一步分析miR-106a表達(dá)水平與結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲遷移能力以及結(jié)腸癌患者5年生存率之間的關(guān)系。
(2)通過轉(zhuǎn)染miR-106ainhibitor或miR-106a逆轉(zhuǎn)錄病毒過表達(dá)載體分別下調(diào)SW480細(xì)胞或上調(diào)HT29細(xì)胞miR-106
4、a表達(dá)水平,體外實(shí)驗(yàn)觀察miR-106a表達(dá)改變對(duì)2種結(jié)腸癌細(xì)胞株侵襲、遷移及增殖能力的影響;體內(nèi)試驗(yàn)觀察miR-106a對(duì)移植瘤成瘤及浸潤能力的影響。
(3)生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)miR-106a靶基因,然后結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),RealtimeRT-PCR和免疫印跡的方法,篩選并驗(yàn)證miR-106a的靶基因,初步明確miR-106a的發(fā)揮生物學(xué)作用的分子機(jī)制。
[結(jié)果]:
(1)Real-timeRT
5、-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在50例結(jié)直腸癌組織中,伴有轉(zhuǎn)移組結(jié)直腸癌組織(22例)中miR-106a表達(dá)水平顯著高于無轉(zhuǎn)移組結(jié)直腸癌組織(28例);miR-106a表達(dá)較高組(25例)的5年無轉(zhuǎn)移生存率相較于低表達(dá)miR-106a組(25例)明顯減低;5種結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-106a表達(dá)水平均比人永生化腸上皮細(xì)胞(NCM-460)高,5種結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)miR-106a的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞侵襲能力呈正相關(guān)。
(2)成功構(gòu)建了miR-10
6、6a的過表達(dá)載體并包裝成病毒,篩選出穩(wěn)定過表達(dá)miR-106a的結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29/retro-miR-106a,Rea1-timeRT-PCR檢測(cè)顯示miR-106a在HT29/retro-miR-106a細(xì)胞中的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高。
(3)抑制miR-106a表達(dá)水平能有效抑制SW480細(xì)胞遷移及侵襲,但對(duì)細(xì)胞增殖無影響;HT29/retro-miR-106a細(xì)胞的體外侵襲、遷移能力明顯增強(qiáng),而細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組無差
7、異,在裸鼠體內(nèi),HT29/retro-miR-106a細(xì)胞的成瘤能力與對(duì)照組無差異,但移植瘤侵襲能力明顯增強(qiáng)。
(4)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合靶基因功能分析,篩選出miR-106a的一個(gè)潛在靶基因TGFBR2。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了該靶序列,Real-timeRT-PCR及Immunoblot證實(shí)miR-106a可以抑制TGFBR2mRNA及蛋白的表達(dá)。
[結(jié)論]:
miR-106a在伴轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌
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