AGEs誘導足細胞表達MCP-1以及細胞內信號傳導機制的實驗研究.pdf

1、該研究的目的是證明RAGE配體(AGEs和CML)是否能直接誘導足細胞表達MCP-1,并了解RAGE激活后的細胞內信號傳導途徑.我們使用條件不朽的小鼠足細胞株進行研究.RT-PCR和ELISA的方法檢測小鼠足細胞的MCP-1的基因表達和蛋白質的產生.應用激光共聚焦顯微鏡觀察AGEs和CML誘導的細胞內氧自由基(ROS).Western blotting、EMSA、免疫細胞染色和免疫組織化學染色等方法檢測細胞外信號調節(jié)激酶,NF-κB和S

2、p1蛋白的激活.RT-PCR檢測PKC和PI3K在RAGE信號傳導中的作用.結果顯示1、AGEs可以以時間依賴的方式誘導足細胞表達MCP-1基因,AGEs刺激足細胞4小時時MCP-1的mRNA表達達到最高.AGEs和CML均可以以劑量依賴的方式誘導足細胞表達MCP1.ELISA結果提示使用AGEs和CML刺激的足細胞,8小時起MCP-1蛋白的表達高于BSA孵育的足細胞,分別是7.44±1.01,8.06±0.96pg/mg和3.766±

3、0.3pg/mg(p<0.01),24小時后MCP-1的表達分別增加到87.78±9.32,85.35±9.83和17.95±0.76pg/mg,(p<0.0001).2、RAGE的另外一個配體,S100蛋白,也能以劑量依賴的方式誘導足細胞表達MCP-1.RAGE中和抗體完全阻斷了AGEs、CML和S100的作用.3、我們發(fā)現(xiàn)血清饑餓的足細胞細胞核內存在基礎性的自由氧離子(ROS),AGEs和CML均可以誘導細胞漿內快速產生ROS.N-

4、乙酰-L-半胱氨酸(NAC)可以抑制基礎的和誘導性的ROS形成,而RAGE中和抗體則完全抑制誘導性的ROS產生.NAC也直接抑制了CML以及外源性H2O2誘導的MCP-1的表達.使用CML刺激足細胞后10分鐘就可以發(fā)現(xiàn)磷酸化的ERK產生,30-60分鐘達到最高.直到CML刺激足細胞120分鐘仍沒有發(fā)現(xiàn)磷酸化的P38MAPK和SAPK/JNK表達或上調.然而使用NAC,AFC預處理細胞可以完全防止ERK的激活并抑制MCP-1基因表達,而P

5、D98059雖然阻斷了ERK的激活卻并不能完全抑制MCP-1的mRNA的產生.我們沒有發(fā)現(xiàn)p38MAPK、SPAK/JNK、PI3K和PKC在信號傳導中扮演任何角色.4、在CML的刺激足細胞60分鐘后,細胞核中的轉錄因子NF-κB和Sp1增加.ERK的磷酸化抑制劑PD98059直接抑制NF-κB的激活,而不影響細胞核內Sp1的表達增多.Parthenolide和光輝霉素A,NF-κB和Sp1的抑制劑,劑量依賴地抑制MCP-1的基因表達.