Spindlin1和Aurora-A激酶相互作用的研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴重危害人們健康生活的疾病,死亡率居高不下,尋求新的腫瘤相關(guān)基因,具有重要的理論與社會意義。在早期研究中,我們對人卵巢癌相關(guān)基因進行了篩選和研究,克隆、鑒定并命名了人Spindlin1基因,該基因與小鼠spindlin基因高度同源,同屬于Spin/Ssty基因家族。Spin/Ssty基因家族被證實參與配子發(fā)生過程,并在早期胚胎中檢測到其表達。在進一步的研究中,我們發(fā)現(xiàn)Spindlin1定位于細胞核,過表達Spindlin1的N

2、IH3T3細胞不僅具有明顯的克隆形成和遷移能力,并且能使裸鼠成瘤。之后,我們又證明過表達Spindlin1會導(dǎo)致細胞出現(xiàn)多核,G2/M期細胞阻滯,紡錘體組裝異常,有絲分裂災(zāi)變及基因組不穩(wěn)定等現(xiàn)象。以上研究結(jié)果提示我們:Spindlin1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。但是,對于Spindlin1發(fā)揮其生物學作用的分子機制仍尚未明了。
　　Aurora-A激酶屬于Ser/Thr激酶,是Aurora激酶家族的重要成員,該激酶家族主要在

3、中心體成熟分離和胞質(zhì)分裂過程中扮演重要角色。目前已報道Aurora-A激酶在多種類型腫瘤細胞中具有高水平表達,并且在50％以上的卵巢癌和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)Aurora-A激酶的表達水平明顯上升,并伴隨其激酶活性的增強。Aurora-A激酶表達異常會破壞細胞周期多個檢測點功能,導(dǎo)致紡錘體組織異常及胞質(zhì)分離異常,最終形成非整倍體細胞,與腫瘤發(fā)生過程密切相關(guān)。Aurora-A激酶參與多種腫瘤相關(guān)信號通路的調(diào)控,近年來對Aurora-A激酶及其作用底

4、物在腫瘤發(fā)生中的作用機制已成為研究熱點,但關(guān)于Aurora-A激酶調(diào)控的下游分子更為詳細的作用機制仍有許多不為人知。對其新的作用底物不斷研究發(fā)現(xiàn)的過程,為我們研究腫瘤藥物靶向分子提供了新的思路。
　　我們的前期研究發(fā)現(xiàn),Spindlin1表達異常時與Aurora-A激酶過度表達產(chǎn)生的細胞有絲分裂期阻滯,紡錘體組織紊亂,多核等諸多現(xiàn)象存在相似之處,除此之外兩者在有絲分裂期亞細胞定位上也有類似的紡錘體分布定位,這些信息提示我們二者在時

5、空上存在相互作用的可能性。此外,我們之前在對Spindlin1的三維晶體結(jié)構(gòu)研究中,發(fā)現(xiàn)Spindlin1的結(jié)構(gòu)分為三個序列上非常類似的重復(fù)結(jié)構(gòu)域,存在磷酸根配體的結(jié)合位點,意味著磷酸化修飾可能對Spindlin1發(fā)揮生物學功能起著重要作用。以上現(xiàn)象使我們有理由推測:Spindlin1可能是Aurora-A激酶新的作用底物,受到其作用而發(fā)生磷酸化修飾變化;Aurora-A激酶的磷酸化作用有可能對Spindlin1生物學功能的發(fā)揮產(chǎn)生重要

6、作用。
　　為了驗證我們的假設(shè),在本課題中我們進一步明確Spindlin1的生物學功能,并在此基礎(chǔ)上展開Spindlin1與Aurora-A激酶相互作用的研究。
　　首先,為研究Spindlin1對腫瘤細胞增殖的影響,我們利用慢病毒包裝系統(tǒng)篩選出穩(wěn)定外源表達Spindlin1的幾株單克隆腫瘤細胞株,用克隆形成、CCK-8及裸鼠成瘤實驗從體外和體內(nèi)水平證明了Spindlin1能促進腫瘤細胞的增殖能力。其中Spindlin1能夠

7、使腫瘤細胞的克隆形成能力增至1.7-3.1倍,并導(dǎo)致裸鼠成瘤的質(zhì)量增長至2.4倍。同時,我們將合成的小分子干擾RNA(siRNA)瞬時轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞中,降低內(nèi)源性Spindlin1的表達,進行克隆形成和CCK-8細胞增殖實驗,證明Spindlin1表達量降低之后,腫瘤細胞的生長速度也受到抑制,克隆形成能力降低46%。其次,在利用Millicell進行的體外侵襲實驗中,我們證明了Spindlin1過表達會導(dǎo)致腫瘤細胞的侵襲能力增至3倍。最

8、后,我們用Hoechst33258對細胞核進行染色,統(tǒng)計凋亡細胞比例,證明了過表達Spindlin1會少量促進腫瘤細胞凋亡,但作用并不十分顯著。以上實驗結(jié)果證明了Spindlin1的癌基因特性。
　　然后,我們對Spindlin1與Aurora-A激酶之間的相互作用進行了驗證。我們先通過免疫熒光染色,觀察到Spindlin1和Aurora-A激酶在細胞有絲分裂間期定位于中心體,在有絲分裂前期到末期定位于紡錘體兩極,證明Spindl

9、in1和Aurora-A激酶存在有絲分裂亞細胞共定位。隨后我們通過GST-Pulldown實驗和Co-IP實驗分別從體外和體內(nèi)證明Spindlin1與Aurora-A激酶存在直接的相互作用。接著我們用體外激酶實驗證明Spindlin1能夠被Aurora-A激酶磷酸化,并進一步通過構(gòu)建Spindlin1截短體和突變體進行體外激酶實驗,證明Aurora-A激酶磷酸化Spindlin1Ser84位和Ser99位。最后,為觀察Spindlin1

10、磷酸化位點對其生物學功能的影響,我們構(gòu)建了Spindlin1Ser84/99Ala聯(lián)合突變體,進行克隆形成、CCK-8和裸鼠成瘤實驗,證明了Spindlin1磷酸化位點突變會降低其對腫瘤細胞增殖的促進作用,即磷酸化位點修飾變化與Spindlin1的生物學功能相關(guān)。其中磷酸化位點突變使腫瘤細胞的克隆形成能力降低43%,并導(dǎo)致裸鼠成瘤的質(zhì)量降低69%。以上結(jié)果證明:Spindlin1是Aurora-A激酶新的作用底物,磷酸化位點是Ser84

11、和Ser99位,這兩個位點的磷酸化對于Spindlin1維持其生物學功能是不可或缺的。
　　在確認Spindlin1是Aurora-A激酶新的作用底物,并驗證Spindlin1磷酸化位點對維持其功能的作用之后,我們開始思考被Aurora-A激酶磷酸化的Spindlin1是通過何種途徑發(fā)揮其對腫瘤生長的促進作用呢?前期的預(yù)實驗表明Spindlin1可能與在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用的Wnt/TCF-4信號通路相關(guān),因此在本部分實

12、驗中我們以TCF-4為切入點展開對Spindlin1作用機制的研究。首先我們用GST-Pulldown證明了Spindlin1與TCF-4在體外存在直接相互作用,之后又利用TCF/β-catenin報告載體——pTOPFlash,通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)證明Spindlin1能夠促進Wnt/TCF-4通路活性1.6-3.6倍。另外我們還選取了對細胞增殖及細胞周期具有調(diào)控作用的Wnt/TCF-4信號通路的下游信號分子c-Myc和Cyclin

13、D1作為研究對象,通過RT-PCR和Westernblot的方法證明Spindlin1的過表達會促進這些信號分子在mRNA水平和蛋白水平的表達,這些結(jié)果表明Spindlin1可能通過Wnt/TCF-4信號通路發(fā)揮生物學作用。為進一步驗證Spindlin1對Wnt/TCF-4信號通路的促進作用與其磷酸化位點的關(guān)系,我們用穩(wěn)定表達Spindlin1Ser84/99Ala聯(lián)合突變體的腫瘤細胞重復(fù)以上Spindlin1對Wnt/TCF-4信號通

14、路作用的實驗后發(fā)現(xiàn),Spindlin1突變體與TCF-4直接相互作用減弱,對Wnt/TCF-4通路活性無促進作用,并且導(dǎo)致Spindlin1對信號通路下游信號分子表達的促進作用也大大降低。以上結(jié)果證明:Spindlin1促進Wnt/TCF-4信號通路活性,其磷酸化位點在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。
　　綜上所述,Spindlin1對腫瘤細胞增殖有明顯的促進作用,它是Aurora-A激酶新的作用底物,Aurora-A激酶磷酸化Spind