長期壓力超負(fù)荷心力衰竭大鼠心肌間質(zhì)、交感神經(jīng)重塑及PKC激活的意義.pdf

1、目的:多種心血管病，如高血壓、心臟瓣膜病、心肌梗死和心肌病等均導(dǎo)致心力衰竭（heart failure，HF），HF導(dǎo)致心血管病患者病殘、死亡的重要原因，HF發(fā)生、進(jìn)展機(jī)制一直是研究的重點。眾所周知，在HF發(fā)生、進(jìn)展過程中，心臟交感神經(jīng)功能(cardiac sympathetic nerve function，CSNF)異常發(fā)揮重要作用。研究證據(jù)表明，心血管病中的CSNF異常，包括交感神經(jīng)活性(sympathetic nerve act

2、ivity，SNA)和/或再攝取功能(reuptake)變化與心肌間質(zhì)重塑有密切關(guān)系，但確切機(jī)制尚不完全清楚。逐漸積累的研究證據(jù)還顯示，發(fā)揮多種細(xì)胞信號調(diào)控作用重要的信號分子蛋白激酶C epsilon(protein kinase C，PKCε)激活，不但可介導(dǎo)神經(jīng)生長、調(diào)控神經(jīng)突觸功能，還參與誘發(fā)心肌間質(zhì)纖維化。由此，我們推測，PKCε激活可能同時對HF的心肌間質(zhì)重塑和CSNF，特別是再攝取功能異常發(fā)揮重要影響。本實驗通過建立以心肌纖

3、維化為特征，同時伴有交感神經(jīng)再攝取功能下降的心臟壓力超負(fù)荷(pressure overload，POL) HF動物模型，觀察動物模型HF時心肌PKCε亞型激活與心臟交感神經(jīng)再攝取功能蛋白膜表達(dá)與心肌間質(zhì)重塑的關(guān)系，并討論P(yáng)KCε激活可能對此發(fā)揮的作用及意義。
　　方法:30只7周雄性Wistar大鼠，按隨機(jī)計數(shù)表法分為2組:假手術(shù)組(SHAM)(n=15)和POL組(n=15)。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，以苯巴比妥％腹腔麻醉，用腹主動脈縮

4、窄方法建立HF動物模型。模型建立8周后，檢測心臟血流動力學(xué)變化，大鼠固定后，麻醉，，行頸動脈插管，將導(dǎo)管置于左心室，待狀態(tài)穩(wěn)定后，記錄有創(chuàng)血流動力學(xué)的各項指標(biāo):左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure、LVSP)、左心室舒張末壓(leftventricular end-diastolic pressure、LVEDP)、左心室壓力變化最大速率(maxmaximal rate of rise of

5、 left ventricular pressure and max maximal rate ofdecline of left ventricular pressure、±dp/dtmax)，檢測完畢，生理鹽水灌流，摘取心臟及雙側(cè)頸交感神經(jīng)節(jié)，分裝入凍存管，于液氮罐內(nèi)保存。
　　各組動物心肌組織HE染色后，用顯微鏡檢測左心室心肌細(xì)胞形態(tài)。用分子生物學(xué)方法檢測去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及mRNA表達(dá):RT-PCR法檢測頸交感神經(jīng)節(jié)中N

6、ET的mRNA表達(dá);免疫組織化學(xué)方法檢測交感神經(jīng)標(biāo)志物——酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)及新生神經(jīng)標(biāo)記物——生長相關(guān)蛋白（Growth Associated Protein43，GAP43）表達(dá);WesternBlot法檢測心臟組織中NET和PKCε細(xì)胞膜及胞漿中蛋白表達(dá);由圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus6.0)處理各組大鼠心肌組織圖像，用SPSS13.0軟件進(jìn)行各組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.

7、05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1心臟血流動力學(xué)檢測:POL組大鼠左室收縮壓(LVSP)降低(P＜0.05)，左室舒張末壓(LVDEP)升高(P＜0.05)，左心室壓力變化最大速率(±dp/dtmax)降低(P＜0.05)，表明POL組大鼠發(fā)生心力衰竭，處于失代償期。
　　2心臟和體重重量比值（Heart Weight/Body Weight，HW/BW）:POL組是SHAM組的1.34倍(P＜0.05)，表

8、明長期心臟POL誘導(dǎo)心臟肥大，并觀察到POL組的左室腔明顯縮小，室壁增厚。
　　3放免法測定血漿去甲腎上腺素濃度:POL組較SHAM組顯著增加(P＜0.05)。
　　4高倍顯微鏡觀測心肌細(xì)胞形態(tài):與SHAM組比較，POL組心肌細(xì)胞長度和直徑增加(P＜0.05)。
　　5心肌間質(zhì)膠原變化:Sirius Red染色及偏光鏡觀察到，心肌間質(zhì)及血管周圍膠原Ⅰ及Ⅲ型均增加，且以Ⅰ型膠原增加明顯，圖像分析顯示POL組間質(zhì)膠原容積分

9、數(shù)(ICVF)為SHAM組1.69倍(P＜0.05)。
　　6心臟交感神經(jīng)密度及神經(jīng)新生:與SHAM組比較，POL組心肌TH蛋白及GAP43蛋白，表達(dá)增加(P＜0.05)。
　　7 PKC激活與NET膜表達(dá):Western Blot結(jié)果顯示:與SHAM組比較，POL組心肌細(xì)胞膜與胞漿中NET蛋白量比值降低(P＜0.05)，說明其NET內(nèi)化明顯;PKCε蛋白的細(xì)胞膜與胞漿比值增高(P＜0.05)，則說明POL組的PKCε活化增

10、多。
　　8心臟神經(jīng)節(jié)NET mRNA表達(dá):RT-PCR結(jié)果顯示，對照組與POL組大鼠神經(jīng)節(jié)中NET mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　長期心臟POL可導(dǎo)致:
　　1向心性心肌細(xì)胞肥厚，心臟重量增加，心肌間質(zhì)纖維化，心功能下降;
　　2 PKCε蛋白激活，蛋白膜表達(dá)增加，同時(1)心臟交感神經(jīng)密度，新生神經(jīng)增加;(2)交感神經(jīng)NET蛋白膜表達(dá)降低，但對心臟神經(jīng)節(jié)NET mRNA表達(dá)水平無影響;