缺氧條件下ADAM17-shRNA對(duì)人MCF-7乳腺癌細(xì)胞侵襲力和遷移力的影響.pdf

1、目的：通過(guò)在缺氧條件下靶向 ADAM-17的短發(fā)夾 RNA（shRNA）抑制人 MCF-7乳腺癌細(xì)胞內(nèi)解聚素-金屬蛋白酶17（A disintegrin and metalloproteinase17，ADAM17）的表達(dá)，并觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞體外侵襲和遷移能力的影響，為開(kāi)辟乳腺癌基因治療提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法：1、使用化學(xué)缺氧法，加入氯化鈷（濃度150Um/L），置37℃、5﹪CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞

2、。2、合成可以表達(dá)針對(duì) ADAM17的短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）的干涉載體，使用 Lipofenectin2000轉(zhuǎn)染至人MCF-7乳腺癌細(xì)胞，用同樣方法轉(zhuǎn)染無(wú)義序列組和正常組，其中無(wú)義序列組加入無(wú)義序列的shRNA，正常組加入相等劑量的磷酸鹽緩沖液（Phosphate-Buffered Saline，PBS）。3、人MCF-7乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染培育48h后，Real-time PCR法檢測(cè)人MCF-7乳

3、腺癌細(xì)胞內(nèi) ADAM17mRNA的表達(dá)程度，并篩選出沉默效果最佳的基因。4. Transwell方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲能力。5、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力。
　　結(jié)果：1、各組 ADAM17mRNA的Ct值均經(jīng)β-actin矯正，以正常組的表達(dá)作為100％。Real-time PCR結(jié)果顯示，ADAM17mRNA在正常組細(xì)胞中高表達(dá)，無(wú)義序列的shRNA并不能降低這種表達(dá)，但特異性的ADAM17-shRNA卻可以明顯抑制A

4、DAM17mRNA的表達(dá)，同正常組或無(wú)義序列組比較，差異具有顯著性（P<0.05），說(shuō)明特異性的轉(zhuǎn)染 ADAM17-shRNA可抑制人 MCF-7乳腺癌細(xì)胞表達(dá) ADAM17。同時(shí)挑選出沉默效果最佳的ADAM17-shRNA-1219用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、Transwell結(jié)果顯示，缺氧條件下正常組的人 MCF-7乳腺癌細(xì)胞可明顯的穿過(guò)鋪有 Matrigel的人工基底膜到達(dá)下室，侵襲細(xì)胞數(shù)量為100.60±5.45個(gè)/視野。在無(wú)義序列組，到

5、達(dá)下室的細(xì)胞數(shù)量與正常組比較差異無(wú)顯著性（P>0.05），說(shuō)明無(wú)義序列 shRNA并不能使人 MCF-7乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力減弱。但在 ADAM17-shRNA轉(zhuǎn)染組，穿過(guò)人工基底膜到達(dá)下室的人 MCF-7乳腺癌細(xì)胞數(shù)量為37.94±4.97個(gè)/視野，與正常組比較差異具有顯著性（P<0.05），說(shuō)明在缺氧條件下特異性 ADAM17-shRNA可抑制人 MCF-7乳腺癌細(xì)胞的侵襲力。3、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48 h后，缺氧條件下無(wú)義序

6、列組和正常組的劃痕已基本長(zhǎng)滿細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染組shRNA-ADAM17的細(xì)胞劃痕依然明顯。表明缺氧條件下轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移速度明顯慢于正常組及無(wú)義序列組的細(xì)胞。
　　結(jié)論：1、針對(duì)ADAM17的shRNA可以有效地抑制ADAM17的表達(dá)。2、在缺氧條件下ADAM17- shRNA抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲力。3、在缺氧條件下ADAM17- shRNA抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力。4、在缺氧條件下ADAM17在乳腺癌侵襲行為中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，ADA