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文檔簡介
1、[研究背景及目的]
肝纖維化(hepatic fibrosis)的特征性病理改變是肝內(nèi)細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的過多沉積。減少ECM沉積、促進ECM降解是治療肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator,uPA)、纖溶酶(plasmin)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inh
2、ibitor-1,PAI-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)構(gòu)成的反應(yīng)體系是調(diào)節(jié)ECM降解的主要途徑之一,在肝纖維化形成和發(fā)展中起重要作用。uPA位于纖維化調(diào)控的上游,可激活纖溶酶原形成纖溶酶,后者可進一步活化MMPs;纖溶酶和活化的MMPs均可降解膠原、蛋白多糖等ECM成分。PAI-1可與uPA結(jié)合,抑制uPA對纖溶酶原的激活作用,從而促進ECM沉積和肝纖維化發(fā)展。
正常
3、生理情況下,體內(nèi)uPA和PAI-1表達處于平衡狀態(tài),而在肝纖維化發(fā)生過程中,uPA活性逐漸降低,PAI-1表達則不斷增高,過多表達的PAI-1通過與uPA結(jié)合抑制其纖溶激活作用,進而導(dǎo)致uPA,纖溶酶和MMPs系統(tǒng)活性下調(diào),ECM沉積明顯增加,加重肝纖維化程度。本科室前期研究表明,在肝纖維化過程中上調(diào)uPA表達可以改善肝纖維化進程;此外,近期多項研究結(jié)果還顯示,PAI-1基因敲除小鼠對纖維化形成具有保護作用,而PAI-1過表達小鼠可加重
4、纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此,我們設(shè)想通過下調(diào)肝纖維化過程中PAI-1的表達可能達到治療肝纖維化的目的。
小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)技術(shù)是以轉(zhuǎn)錄后調(diào)控為目的的新型基因調(diào)控與治療技術(shù)。通過合成反義小分子RNA特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達。RNA干擾(RNA interfering,RNAi)具有操作簡單,可調(diào)控性和靶向性強、高效抑制靶基因表達等優(yōu)點。
本研究以肝纖維化過程中
5、上調(diào)的PAI-1基因作為靶點,利用siRNA技術(shù),通過體外、體內(nèi)實驗研究PAI-1 siRNA對實驗性肝纖維化的治療效果,為抗肝纖維化治療提供新的靶點和途徑。
[實驗方法]
一、篩選PAI-1 siRNA
應(yīng)用RNAi設(shè)計軟件,設(shè)計并合成針對PAI-1 mRNA219、559、1061和2665位點的4對21核苷酸(nt)siRNA,分別轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細胞(hepatic stellate ce
6、ll,HSC)株HSC-T6。以轉(zhuǎn)染非特異siRNA(NC siRNA,與PAI-1 mRNA無同源性的21 ntsiRNA)作為陰性對照,應(yīng)用實時定量RT-PCR(real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction,real time RT-pCR)和Western blot方法檢測四對siRNA分子對PAI-1基因及蛋白水平的阻抑效率,篩選出針對PAI-1 mRNA高效的
7、siRNA片段。
二、PAI-1 siRNA對HSC-T6生物學(xué)特性的影響
通過細胞懸液轉(zhuǎn)染以及構(gòu)建穩(wěn)定株兩種方法將篩選出的PAI-1 siRNA轉(zhuǎn)染至HSC-T6內(nèi),應(yīng)用real time RT-PCR法檢測肝纖維化基因mRNA表達;酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定HSC-T6上清Ⅰ、Ⅲ型膠原含量;四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazo
8、lyl tetrazolium,MTT)法測定細胞增殖變化;流式細胞術(shù)檢測分析細胞周期等生物學(xué)特性的影響。
三、針對PAI-1 siRNA的腺病毒載-AdshPAI的構(gòu)建以及鑒定
合成針對219位點的PAI shRNA片段,利用pSuper載體的H1啟動子,體外連接構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdshPAI,經(jīng)293細胞包裝后得到復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdshPAI,同法構(gòu)建對照病毒AdNC(與PAI-1 mRNA無同
9、源性的NC shRNA)和表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)病毒AdGFP。將AdshPAI和AdNC分別體外感染HSC-T6,以RT-PCR法檢測AdshPAI對PAI-1的抑制效果。
四、AdshPAI體內(nèi)導(dǎo)入對實驗性肝纖維化的治療作用
分別構(gòu)建膽總管結(jié)扎(bile duct ligation,BDL)和二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine,DM
10、N)兩種大鼠肝纖維化模型。在BDL模型中,將雄性SD大鼠隨機分為4組,每組10只。分設(shè)假手術(shù)組、模型對照組、病毒AdNC對照組和AdshPAI導(dǎo)入組。鈍性分離并結(jié)扎膽總管,制備BDL肝纖維化模型。于術(shù)前48 h AdNC組和AdshPAI組分別經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入4×109pfu/只AdNC或AdshPAI。于手術(shù)后第21 d處死大鼠。在DMN模型中,將雄性SD大鼠隨機分為4組,每組8只。第1組為正常對照組:第2~4組為肝纖維化模型組,予1%D
11、MN以10μg/kg腹腔注射,每周連續(xù)注射3次,共注射4w。其中第2組設(shè)為模型對照組;第3組為對照病毒AdNC組,第4組為AdshPAI治療組。于DMN注射后2 w末AdNC組和AdshPAI組分別經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入4×109pfu/只AdNC或AdshPAI至大鼠體內(nèi)。于DMN注射后第4 w末處死大鼠。分別采用組織病理方法觀察各組大鼠肝纖維化程度分級改變;肝組織切片采用Masson染色和天狼猩紅(sirius red)染色分析膠原沉積變化;
12、免疫組織化學(xué)法測定PAI-1、平滑肌肌動蛋白-α(α-smooth muscle actin,α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、MMP-9、TIMP-1、Brdu和PCNA表達,圖象分析儀半定量分析;real-time RT-PCR方法檢測肝組織中PAI-1、α-SMA、TGF-β1、Ⅰ型膠原、smad3、smad7、uPA、uPAR、tPA、MMP-2、MMP
13、-9、MMP-13和TIMP-1 mRNA水平;組織勻漿酸水解方法測定肝組織中羥脯氨酸水平;末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL法)檢測肝組織中細胞凋亡情況。
五、統(tǒng)計學(xué)處理
數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行分析,結(jié)果以(-X±S表示。多組間采用One-WayANOVA分析,方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗;細胞周期分析采用X2檢驗。P<0.05為差異有顯著性,P<0.01為差異有非常顯著性。
[結(jié)論
14、]
1.針對大鼠PAI-1 mRNA的219 siRNA,對靶基因有較好的基因沉默效率,抑制效率可達85%。
2.siRNA沉默PAI-1可顯著抑制HSC-T6活化、增殖,合成及分泌膠原。
3.在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中,PAI-1表達明顯上調(diào),AdshPAI治療可下調(diào)PAI-1表達。
4.AdshPAI治療可促進膠原降解,減少肝纖維化大鼠肝內(nèi)膠原沉積,抑制肝纖維化發(fā)展。
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