靶向hTERT的RNA干擾及其對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡影響的機(jī)制研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文靶向hTERT的RNA干擾及其對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡影響的機(jī)制研究姓名：王建申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：任常山20080301液滴于芯片點(diǎn)樣區(qū)，用蓋玻片覆蓋，置于雜交盒中，雜交過夜；使用激光共聚焦熒光掃描儀掃描芯片，用lmaGene軟件分析數(shù)據(jù)；采用Westernblot法驗(yàn)證差異表達(dá)基因。第三部分，實(shí)驗(yàn)分5組：空白對照組，轉(zhuǎn)染試劑對照組，非特異陰性對照組，S3、S4特異干擾組。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，流式細(xì)胞

2、儀檢測各組細(xì)胞凋亡率；轉(zhuǎn)染后48小時(shí)比色法測定各組Caspase3和Caspase8的活性；轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，提取各組細(xì)胞胞漿蛋白，Westernblot法檢測各組細(xì)胞胞漿Cytc含量。結(jié)果第一部分，RNAiMate能有效的將siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，各特異性siRNA轉(zhuǎn)染組hTERTmRNA表達(dá)水平有不同程度的下降，以S3、S4轉(zhuǎn)染組最為顯著，而在各對照組內(nèi)hTERTmRNA水平無明顯變化；Westernblot顯示的蛋白表達(dá)變化與mRN

3、A變化趨勢相一致；MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24后，兩個(gè)特異干擾組S3、S4與陰性對照組比較，細(xì)胞增殖抑制率均顯著增高(PO05)。第二部分，芯片分析結(jié)果顯示，在干擾組與對照組之間的差異表達(dá)基因中，EGFR、VEGF、bcl2三個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，TRAIL基因表達(dá)上調(diào)：Westernblot結(jié)果顯示，各基因的蛋白水平變化與芯片篩選結(jié)果一致。第三部分，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡率分析顯示，各對照組之間的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義渺O05)，而兩個(gè)

4、干擾組與對照組比較，凋亡率均顯著增高(PO05)；轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，各組的easpase8活性比無顯著性差異(P005)，而兩個(gè)干擾組的caspase3活性比與對照組比較差異有顯著性(PO01)，均表現(xiàn)為活性比增高；Westernblot結(jié)果顯示，兩個(gè)干擾組的胞漿Cytc蛋白含量較對照組也有顯著的增高。結(jié)論l、化學(xué)合成的靶向hTERT的siRNA能有效抑制HeLa細(xì)胞中hTERT的表達(dá)，并能抑制HeLa細(xì)胞增殖。2、靶向hTERT的siR