野生型NF2基因質粒的構建及其在真核細胞中的表達.pdf

1、目的：II型多發(fā)神經(jīng)纖維瘤病(NF2)基因是聽神經(jīng)瘤的腫瘤抑制基因，目前NF2基因編碼的蛋白merlin的抑瘤作用機制仍不清楚。近年來研究提示肝細胞生長因子(HGF)調節(jié)的酪氨酸激酶底物(HRS)是merlin的效應蛋白，蛋白merlin 與HRS蛋白作用后可大大增強蛋白merlin的抑制腫瘤增殖能力。為明確蛋白merlin 與HRS蛋白相互作用后抑制腫瘤的具體機制，本研究通過構建pEGFP-NF2 II 型基因，并從基因序列測序、蛋白

2、表達以及這種蛋白對瘤細胞增殖的影響等三方面來驗證所構建質粒的正確性，為下一步繼續(xù)深入研究蛋白merlin 抑瘤信號轉導通路奠定物質基礎。 方法：從人的cDNA胎腦文庫中擴增目的基因并構建pEGFP-NF2 II型基因質粒，將構建好的質粒轉化、擴增并抽提，測定質粒OD值。行雙酶切后做DNA瓊脂糖電泳粗測質粒，然后將精確測序結果與NCBI的標準序列比對。把pEGFP-NF2 II型基因轉染至RT4細胞中，培養(yǎng)轉染細胞，使用水溶性四氮

3、唑（WST-1）法觀察merlin蛋白 II型對細胞增殖的影響。 結果：測序結果顯示，所構建的pEGFP-NF2 II型基因與標準序列相符率為100％。DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示經(jīng)雙酶切后的質粒結果為：pEGFP cDNA大小為4.7kb；NF2 cDNA大小為1.77kb。細胞熒光檢測蛋白merlin在RT4細胞中都可以表達，western-blotting測定merlin-GFP融合蛋白為90KD左右，同理論值相一致。WS