超聲微泡介導野生型p53基因轉(zhuǎn)染Y79細胞的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的 視網(wǎng)膜母細胞瘤是最常見的兒童眼內(nèi)惡性腫瘤。目前的治療方式有直接摘除眼球及剜出眼眶內(nèi)容物、化學減容法、激光光凝、溫熱療法、冷凍療法、外照放療等?；蛑委熒刑幱谘芯侩A段。微泡造影劑作為一種新型的基因轉(zhuǎn)移載體，在聲像圖的監(jiān)控下進行超聲輻照，微泡能夠在指定部位“爆破”，釋放所攜帶的基因。本文通過體外實驗研究超聲微泡造影劑攜帶野生型p53(wtp53)基因?qū)σ暰W(wǎng)膜母細胞瘤細胞進行轉(zhuǎn)染的效率及探討wtp53基因?qū)σ暰W(wǎng)膜母細胞

2、瘤細胞的作用效果。 第一部分超聲波對Y79細胞生長活性的影響 方法 將培養(yǎng)的Y79細胞分為6組，其中3組分別予以超聲條件為0.5、0.75、1.OW/cm<'2>，作用時間均為60s的連續(xù)波輻照，另外3組分別予以超聲條件為0.5、0.75、1.0W/cm<'2>，作用時間均為30s的連續(xù)波輻照。用0.4％臺盼藍直接染色4min，顯微鏡觀察，計數(shù)被染色(死)細胞和拒染(活)細胞。 結(jié)果 臺盼藍染色結(jié)

3、果顯示：當超聲強度為1.0W/cm<'2>，輻照時間不論是60s還是30s，細胞存活率均<50％；當超聲強度為0.5、0.75W/cm<'2>，輻照時間60s時，細胞存活率均<70％；當超聲強度為0.5、0.75W/cm<'2>，輻照時間30s時，細胞存活率均>90％。 結(jié)論 在0.5-0.75W/cm<'2>，30s范圍內(nèi)的超聲，對Y79細胞的生存無影響，0.5W/cm<'2>條件下Y79細胞的存活率更高，與0.75W

4、/cm<'2>的差異具有統(tǒng)計學意義。 第二部分超聲微泡介導野生型p53基因轉(zhuǎn)染Y79細胞與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法效率的比較 方法 第二部分在第一部分實驗的基礎(chǔ)上，以0.5W/cm<'2>聲強，輻照時間30s的連續(xù)波，對Y79細胞進行wtp53基因的轉(zhuǎn)染，并同傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行了轉(zhuǎn)染效率的對比。Y79細胞分為三組，以不同的轉(zhuǎn)染方法進行、wtp53基因的轉(zhuǎn)染。①質(zhì)粒+微泡+超聲照射轉(zhuǎn)染；②質(zhì)粒+脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；③質(zhì)粒+超聲照射

5、轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)24-48h后，用RT-PCR定量檢測mRNA表達。 結(jié)果 RT-PCR顯示第①組(質(zhì)粒+微泡+超聲照射組)和第②組(質(zhì)粒+脂質(zhì)體組)可見較亮的電泳條帶，第①組的、wtp53/β-actin光密度比值較第②組大，二者的差異具有統(tǒng)計學意義，第③組(質(zhì)粒+超聲照射組)未檢測到目的基因表達。 結(jié)論 濃度適當?shù)奈⑴菰趦?yōu)化的聲強條件下，可獲得wtp53基因?qū)79細胞較高的轉(zhuǎn)染效率，超聲微泡作為一種新型的

6、轉(zhuǎn)染介質(zhì)，可達到高效的基因轉(zhuǎn)染目的。 第三部分野生型p53基因轉(zhuǎn)染后對Y79細胞生長活性的影響 方法 把Y79細胞分為四組，以不同的轉(zhuǎn)染方法進行wtp53基因的轉(zhuǎn)染，①質(zhì)粒+微泡+超聲照射轉(zhuǎn)染；②質(zhì)粒+脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；③質(zhì)粒+超聲照射轉(zhuǎn)染；④空白對照組(即不施加任何處理)。培養(yǎng)培養(yǎng)24-48h后，用流式細胞儀檢測Y79細胞的凋亡情況。 結(jié)果 流式細胞儀檢測顯示第①組(質(zhì)粒+微泡+超聲照射組)細胞凋亡率