RNA干擾ILK基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞侵襲遷移的影響.pdf

1、目的:通過RNA干擾結(jié)腸癌細(xì)胞ILK基因，逆轉(zhuǎn)上皮間葉變，促進(jìn)間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)變，探討其對侵襲遷移的影響。
　　 方法:1.設(shè)計針對ILK基因shRNA，并構(gòu)建pGenesil1.2-ILK shRNA重組質(zhì)粒。培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620、SW480和HT29，應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測三種細(xì)胞ILK的mRNA和蛋白表達(dá)，篩選三種細(xì)胞中表達(dá)ILK最高的結(jié)腸癌細(xì)胞系。2.陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)pGenesil1.2-IL

2、K shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞，實驗分三組:(1)空白對照組:未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組。(2)實驗組:轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil1.2-ILKshRNA細(xì)胞組;(3)陰性對照組:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pGenesil1.2細(xì)胞組。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。應(yīng)用實時熒光定量PCR和Western blot檢測結(jié)腸癌細(xì)胞RNA干擾后，ILK mRNA及蛋白水平表達(dá)。3.實時熒光定量PCR和Westernblot檢測與細(xì)胞上皮間質(zhì)化有關(guān)的E-cadherin和

3、Vimentin的mRNA及蛋白水平表達(dá)。4.Transwell小室遷移和侵襲實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　 結(jié)果:1.三種結(jié)腸癌細(xì)胞SW620、SW480和HT29中，SW620的ILK mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于SW480和HT29，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。篩選出高表達(dá)ILK的結(jié)腸癌細(xì)胞SW620進(jìn)行下一步實驗。
　　 2.ILK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞SW62048小時后，熒光定量PCR結(jié)

4、果顯示，實驗組ILK mRNA表達(dá)水平與對照組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示實驗組ILK蛋白表達(dá)水平與對照組相比也明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 3.ILK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞SW62048小時后，實驗組E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于陰性對照組和空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。實驗組Vimentin mRN

5、A和蛋白表達(dá)水平低于陰性對照組和空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.Transwell遷移實驗示轉(zhuǎn)染48小時后，實驗組、陰性對照組和空白對照組通過小室膜的細(xì)胞數(shù)分別為134.94±4.76、196.76±4.97和203.35±7.31。實驗組穿過小室膜細(xì)胞數(shù)明顯低于其它兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Transwell侵襲實驗示細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時后，實驗組、陰性對照組和空白對照組通過Matrige

6、l膠的細(xì)胞數(shù)目分別為36.44±3.31、86.8±2.17和88.56±4.02。實驗組通過Matrigel膠細(xì)胞數(shù)明顯低于其它兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:1、在人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620、SW480和HT29中，結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的ILK表達(dá)最高。
　　 2、結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染ILK shRNA質(zhì)粒后，實驗組ILK水平明顯低于對照組，干擾ILK基因可以有效地沉默結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的ILK基因表達(dá)