AP-2α對滋養(yǎng)細胞功能的影響及在重度子癇前期發(fā)病機制中作用的研究.pdf

1、重度子癇前期是妊娠期特有的疾病，是引起孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一。雖然近幾年來關于它的研究有了更深的認識，但其確切的病因至今國內(nèi)外尚未闡明。因此，對于重度子癇前期發(fā)病機制的進一步探討，已經(jīng)成為國內(nèi)外學者關注的焦點。
　　 重度子癇前期的發(fā)病機制非常復雜，涉及到多種因素，目前普遍認為:孕早期胎盤淺著床和血管重塑障礙是重度子癇前期發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。胎盤滋養(yǎng)細胞正常分化、遷移、侵襲和凋亡是胚胎著床和胎盤形成的重要保障。一旦平衡失調(diào)

2、，將導致孕早期胎盤滋養(yǎng)細胞發(fā)生過度凋亡，削弱了滋養(yǎng)細胞的侵襲力，從而引起胎盤形成和發(fā)育的畸形，這可能是重度子癇前期發(fā)病的關鍵因素。因此，本次課題研究以能影響滋養(yǎng)細胞侵襲及凋亡生物學行為的因素作為切入點，進一步探討重度子癇前期的發(fā)病機制。
　　 轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-2α(AP-2α)是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過信號轉(zhuǎn)導通路轉(zhuǎn)錄性調(diào)控其下游靶基因的表達，從而參與脊椎動物的生長發(fā)育過程;同時又因為AP-2α能影響腫瘤細胞的遷移、侵襲及細胞

3、凋亡等功能，所以AP-2α與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展也密切相關。SchwartZ等發(fā)現(xiàn)在晚期結(jié)腸癌細胞中，存在AP-2α表達缺失的現(xiàn)象，當采用AP-2α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞系SW480時，發(fā)現(xiàn)SW480細胞中E-cadherin的表達增加，MMP-9的表達及活性降低，同時，也發(fā)現(xiàn)AP-2α能使結(jié)腸癌細胞侵襲性和致瘤性減弱的現(xiàn)象，這一研究結(jié)果表明，AP-2α是通過調(diào)節(jié)E-cadherin和MMP-9的表達，在結(jié)腸癌的發(fā)生及癌細胞遠處轉(zhuǎn)移的過程中起著

4、重要的調(diào)控作用。胎盤滋養(yǎng)細胞類似于腫瘤細胞，也具有遷移及侵襲等特征，而其侵襲性主要依賴于大量的蛋白水解酶（如:MMP-2、MMP-9等）及細胞粘附分子（如E-cadherin）等，共同參與細胞外基質(zhì)的降解而得以實現(xiàn)的。那么AP-2僅是否也能通過調(diào)控滋養(yǎng)細胞中MMP-9及E-cadherin的表達，而影響滋養(yǎng)細胞的侵襲力，從而可能參與子癇前期的發(fā)病呢？對這一觀點的提出，目前國內(nèi)外尚未見報道。越來越多的關于COPD和人乳腺癌等的研究發(fā)現(xiàn)，A

5、P-2α能通過調(diào)節(jié)VEGF、P53、p21WAF/CIP、Bcl-2和MnSOD等的表達，進而參與調(diào)控細胞凋亡過程。多項研究也發(fā)現(xiàn)，Bcl-2和Bax異常表達與子癇前期中滋養(yǎng)細胞發(fā)生過度凋亡有關，那么滋養(yǎng)細胞中Bax和Bcl-2是否也受到AP-2α的直接轉(zhuǎn)錄性調(diào)控，從而誘導滋養(yǎng)細胞發(fā)生過度凋亡，對這一觀點的提出，目前國內(nèi)外也未見報道。
　　 本研究采用免疫組化及realtime-PCR的方法檢測AP-2α與Bax、Bcl-2、M

6、MP-9和E-cadherin在重度子癇前期胎盤組織中的表達，進而通過體外培養(yǎng)人絨毛膜癌滋養(yǎng)細胞株BeWo細胞，分別瞬時轉(zhuǎn)染及干擾BeWo細胞中AP-2α的表達，采用realtime-PCR及Westernblot的方法，從基因及蛋白水平分別檢測AP-2α下游靶基因Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin表達的變化;同時分別采用MTT方法、Transwell方法及FCM方法檢測AP-2α對BeWo細胞增殖、侵襲及凋亡作用的影

7、響，進一步分析AP-2α是否通過直接轉(zhuǎn)錄性調(diào)控Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin的表達，而影響滋養(yǎng)細胞的凋亡及侵襲力等生物學功能，從而說明AP-2α及Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin在重度子癇前期的發(fā)病機制中共同發(fā)揮重要的作用。
　　 第一部分:AP-2α及相關靶基因在重度子癇前期胎盤組織中的表達
　　 目的：
　　 本研究通過分析AP-2α及靶基因Bax、Bcl-2、MMP

8、-9和E-cadherin在重度子癇前期組胎盤組織與正常對照組胎盤組織中的定位和表達的變化，探討AP-2α及其靶基因Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin在子癇前期發(fā)病機制中可能發(fā)揮的作用。
　　 方法：
　　 采用免疫組化的方法，檢測重度子癇前期組胎盤組織及正常對照組胎盤組織中，AP-2α及其靶基因E-cadherin、MMP-9、Bax和Bcl-2的定位及蛋白的相對表達;采用realtime-PCR方法

9、，檢測重度子癇前期組胎盤組織及正常對照組胎盤組織中AP-2α及Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherinmRNA的相對表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組化結(jié)果分析:
　　 (1)AP-2α、Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin蛋白在胎盤組織中，均表達于胎盤滋養(yǎng)細胞及絨毛外滋養(yǎng)細胞，其中AP-2α主要表達于細胞核，E-cadherin主要表達于細胞膜，MMP-9、Bax和Bcl-2主要

10、表達于細胞膜及細胞漿。
　　 (2)重度子癇前期組胎盤組織中，AP-2α、Bax及E-cadherin的陽性表達明顯高于正常對照組(P＜0.05);而Bcl-2和MMP-9在重度子癇前期組胎盤組織中的陽性表達明顯低于正常對照組(P＜0.05)。
　　 2.realtime-PCR結(jié)果分析:
　　 重度子癇前期組胎盤組織中AP-2α、Bax和E-cadherinmRNA的相對表達量均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學

11、意義(P＜0.05);而在重度子癇前期組胎盤組織中Bcl-2和MMP-9mRNA的相對表達量明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 AP-2α及其靶基因Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin可能共同參與子癇前期的病理過程。
　　 第二部分:AP-2α對滋養(yǎng)細胞侵襲、增殖及凋亡作用的研究
　　 目的：
　　 Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadh

12、erin均為轉(zhuǎn)錄因子AP-2α的下游調(diào)控靶基因，根據(jù)第一部分研究結(jié)果提示:重度子癇前期胎盤組織中AP-2α、E-cadherin和Bax的表達異常增高，MMP-9及Bcl-2的表達異常降低。因此，本部分研究我們意在進一步探討，AP-2α是否通過直接轉(zhuǎn)錄性調(diào)控胎盤組織中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin的表達，影響滋養(yǎng)細胞生物學行為，從而誘導子癇前期的發(fā)生及發(fā)展，同時也進一步說明AP-2α在子癇前期的發(fā)病中可能起著重要的

13、調(diào)節(jié)作用，為今后治療子癇前期提供新的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)人絨毛膜癌滋養(yǎng)細胞株BeWo細胞，（BeWo細胞可替代正常胎盤滋養(yǎng)細胞，作為滋養(yǎng)細胞分化、侵襲及凋亡等生物學功能研究的模型），構建AP-2α真核表達載體，分別采用AP-2α表達載體和AP-2αsiRNA瞬時轉(zhuǎn)染BeWo細胞，通過realtime-PCR及Westernblot方法分別檢測BeWo細胞中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadhe

14、rinmRNA及蛋白的表達;采用MTT的方法檢測AP-2α是否影響B(tài)eWo細胞的增殖;通過Transwell小室檢測AP-2α是否影響B(tài)eWo細胞的侵襲行為，以及采用流式細胞術檢測AP-2α是否促進BeWo細胞凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 1.構建人AP-2α基因真核表達載體
　　 經(jīng)測序鑒定，pIRES2-EGFP/AP-2α真核表達載體構建成功。
　　 2.AP-2α質(zhì)粒及AP-2αsiRNA瞬時轉(zhuǎn)染采

15、用pIRES2-EGFP/AP-2α質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染BeWo細胞48h，realtime-PCR檢測結(jié)果顯示:與空質(zhì)粒細胞組及空白細胞組對比，BeWoAP-2α細胞組中AP-2αmRNA的表達顯著增高;采用Westernblot方法檢測轉(zhuǎn)染48h三組BeWo細胞中AP-2α的蛋白表達，統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示:與空質(zhì)粒細胞組及空白細胞組對比，BeWoAP-2α細胞組中AP-2α的蛋白表達顯著增加，故以pIRES2-EGFP/AP-2α真核表達質(zhì)

16、粒轉(zhuǎn)染BeWo細胞48h，作為后續(xù)實驗的檢測時間點。采用3個AP-2αsiRNA片段分別轉(zhuǎn)染BeWo細胞96h，realtime-PCR及Westernblot方法分別檢測AP-2α的基因及蛋白的表達，經(jīng)統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示:與空白細胞組相比，BeWoAP-2αsiRNA1組中AP-2αmRNA及蛋白的表達降低最為顯著(P＜0.05)，故以轉(zhuǎn)染BeWo細胞96h，AP-2αsiRNA1片段作為后續(xù)實驗的干擾片段。
　　 3.AP-

17、2α對BeWo細胞中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin基因及蛋白表達的影響
　　 AP-2α基因真核表達載體轉(zhuǎn)染BeWo細胞48h，realtime-PCR及Westernblot方法分別檢測BeWo細胞中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin基因及蛋白的表達，統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示:與空白細胞組及空質(zhì)粒細胞組對比，BeWoAP-2α細胞組中Bax及E-cadherinmRNA及蛋白的表達明顯增強，而

18、Bcl-2及MMP-9mRNA及蛋白的表達明顯降低。AP-2αsiRNA1轉(zhuǎn)染BeWo細胞96h，realtime-PCR及Westernblot方法分別檢測BeWo細胞中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin基因及蛋白的表達，統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示:與空白細胞組對比，BeWoAP-2αsiRNA1組中Bax及E-cadherinmRNA及蛋白的表達明顯降低，而Bcl-2及MMP-9mRNA及蛋白的表達明顯增高(P＜0.05)

19、。
　　 4.AP-2α對BeWo細胞增殖、侵襲及凋亡行為的影響
　　 AP-2α基因真核表達載體轉(zhuǎn)染BeWo細胞后，采用MTT方法檢測BeWo細胞增殖率，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染AP-2α質(zhì)粒細胞組與空質(zhì)粒細胞組及空白細胞組對比，無顯著性差異;經(jīng)Transwell小室對BeWo細胞侵襲細胞數(shù)量的檢測統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染AP-2α質(zhì)粒細胞組與空質(zhì)粒細胞組及空白細胞組對比，細胞侵襲的數(shù)量顯著減少。
　　 AP-2α基因

20、真核表達載體轉(zhuǎn)染BeWo細胞后，經(jīng)流式細胞儀方法檢測細胞凋亡率，統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示:與空質(zhì)粒細胞組及空白細胞組對比，轉(zhuǎn)染AP-2α質(zhì)粒細胞組中細胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)。AP-2αsiRNA1轉(zhuǎn)染BeWo細胞后，與空白細胞組對比，BeWo細胞凋亡率則顯著降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.構建pIRES2-EGFP/AP-2α真核表達載體，并成功轉(zhuǎn)染人絨毛膜癌滋養(yǎng)細胞株BeWo細胞;
　　 2

21、.體外研究進一步證實，AP-2α通過轉(zhuǎn)錄性調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞中E-cadherin和MMP-9的表達，起到抑制滋養(yǎng)細胞侵襲力的作用，為進一步闡明滋養(yǎng)細胞侵入不足與子癇前期發(fā)病的關系，提供了參考的理論依據(jù)。
　　 3.體外研究進一步證實，AP-2α通過轉(zhuǎn)錄性調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞中Bax和Bcl-2的表達，起到促進滋養(yǎng)細胞凋亡的作用，為進一步闡明滋養(yǎng)細胞過度凋亡與子癇前期發(fā)病的關系，提供了可靠依據(jù)，同時也為子癇前期發(fā)病機制的研究提供一個新的研究方