MAP4調控滋養(yǎng)細胞遷移在子癇前期發(fā)病中作用的研究.pdf

1、目的:
　　子癇前期(pre-eclampsia，PE)是一個病因未明的復雜疾病，以母體高血壓、蛋白尿等為特征，約占妊娠婦女的5％-8％[1]。病情嚴重時，將導致母親子癇抽搐的發(fā)生以及胎兒宮內死亡。唯一確切的治療方式就是胎兒及其附屬物娩出，但卻增加了新生兒早產的發(fā)生率[2]。子癇前期治療效果不佳的癥結主要是其病因不明，目前的病因學研究主要集中在滋養(yǎng)細胞功能異常及早期胎盤形成不良。
　　胎盤形成和胚胎植入是早期妊娠必經的過程，

2、是妊娠延續(xù)中最重要的決定因素之一。滋養(yǎng)細胞的侵襲為胎盤形成奠定基礎，其侵襲程度決定了胎盤的穩(wěn)定性和胎盤與蛻膜結合的深度。同時，滋養(yǎng)細胞錨定子宮螺旋動脈確保了胎兒有足夠的氧和營養(yǎng)物質供應，當滋養(yǎng)細胞侵襲不足、局部功能障礙，將導致許多嚴重的產科并發(fā)癥發(fā)生，如流產、子癇前期、胎盤早剝、死胎等。而滋養(yǎng)細胞侵襲過度將導致滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)生，如侵襲性葡萄胎、絨毛膜癌等，對母體的生命造成傷害。因此，只有胚胎侵襲入母體與母體在這一過程中的自救相互平衡，

3、胚胎才能得以順利孕育。早期胚胎中染色體核型異常時，大多數(90％)都被自然淘汰而流產了，而染色體核型正常的早期胚胎，大多數(93％)都繼續(xù)妊娠，顯著地體現了胚胎與母體之間的這一平衡[3]。因此，流產是滋養(yǎng)細胞侵襲失敗的結局，是自然質量控制的結果。所有影響滋養(yǎng)細胞侵襲和錨定在子宮螺旋動脈的因素，勢必決定著胚胎孕育的成敗。
　　滋養(yǎng)細胞的侵襲受到胞內和胞外許多信號通路的精細調節(jié)，涉及識別并消化細胞外基質、定向遷移等多個過程，其中，滋養(yǎng)

4、細胞的定向遷移是侵襲行為的關鍵步驟。
　　與絕大多數細胞遷移模式相同，滋養(yǎng)細胞的定向遷移包括細胞極化、偽足形成、基質粘連、尾部釋放、胞體收縮等多個環(huán)節(jié)，而細胞骨架和粘連結構的動態(tài)重組是一個基礎環(huán)節(jié)，也是各種因素調控滋養(yǎng)細胞遷移的重要靶點[4,5]。細胞骨架主要由微管和微絲組成，我們課題組前期研究發(fā)現，表皮生長因子(EGF)通過微絲結構重組刺激人滋養(yǎng)細胞遷移，而關于微管與滋養(yǎng)細胞遷移之間關系的研究較少。微管是具有極性的中空管狀結構，

5、在細胞內的分布呈束網狀，并構成一個軌道運輸系統(tǒng)，多種細胞物質如囊泡、細胞器等均順著其極性方向移動，并且，微管還參與中心粒等的裝配、細胞形態(tài)維持、細胞運動和分裂等過程[6，7]。微管骨架穩(wěn)定聚合的調節(jié)依賴于一系列結合于微管內、外側的微管結合蛋白(microtubule-associated protein，MAP)，其中MAP4在人滋養(yǎng)細胞有表達，是促進滋養(yǎng)細胞微管穩(wěn)定延長的正性調節(jié)因素。微管在胞內的穩(wěn)定聚合、延長方向可以精確地指向細胞與

6、胞外基質粘連的粘著斑部位，微管向粘著斑移動與細胞周圍的粘著斑溶解有關。對于遷移的細胞，依賴微管的粘著斑溶解對于分解細胞后方粘著斑十分重要[8]。
　　JEG-3細胞來源于人絨毛膜癌組織，其形態(tài)、生化標志、功能等細胞特征與絨毛組織原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)細胞最為相似。因此，本實驗用JEG-3細胞研究人滋養(yǎng)細胞的遷移和可能機制。
　　方法:
　　第一部分:缺氧通過MAP4對滋養(yǎng)細胞遷移的調控及機制的研究
　　1.常氧和低氧培養(yǎng)

7、滋養(yǎng)細胞，根據缺氧時間將細胞分為五組0h、6h、12h、18h、24h組;
　　2.Transwell法分析滋養(yǎng)細胞侵襲性遷移能力;
　　3.免疫熒光染色分析滋養(yǎng)細胞內微管、黏著斑結構變化;
　　4.Western-blot法檢測蛋白表達的變化;
　　5.使用EXCEL及SPSS軟件整理數據。
　　第二部分:MAP4、細胞骨架蛋白在子癇前期患者胎盤組織中的表達
　　1.搜集選取第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院

8、（大坪醫(yī)院）產科2013年01月-2014年03月收治的重度子癇前期患者（PE組）20例和正常晚孕患者（control組）20例行擇期剖宮產后的胎盤組織;
　　2.通過組織HE染色研究實驗組和對照組胎盤組織中絨毛和血管的差異;
　　3.通過組織免疫組化研究胎盤絨毛組織中相關分子的定位及表達;
　　4.提取胎盤絨毛相關蛋白，行western-blot分析其表達量。
　　結果:
　　1.低氧抑制滋養(yǎng)細胞侵襲，6

9、h組與0h組比較，侵襲能力明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;隨著缺氧時間的延長，滋養(yǎng)細胞侵襲能力進一步降低，12h組與0h組、6h組比較，18h組與12h組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　2.隨著缺氧時間延長，MAP4、微管蛋白表達逐漸降低，微管逐漸解聚、黏著斑逐漸聚合，黏著斑蛋白表達逐漸增多;
　　3.與正常對照組相比，PE組胎盤組織血管痙攣、閉塞、血流量減少;
　　4.與正常對照組相比，P

10、E組胎盤組織中微管蛋白和MAP4蛋白表達較少、黏著斑蛋白表達較多，與滋養(yǎng)細胞低氧環(huán)境中表達一致。
　　結論:
　　1.低氧環(huán)境中，MAP4的變化可能通過影響細胞骨架中微管的聚合和黏著斑的形態(tài)調控滋養(yǎng)細胞遷移;
　　2.PE患者胎盤組織血管痙攣、閉塞、血流量減少，絨毛發(fā)育不良，可能與局部血管病變有關，為臨床胎盤缺血缺氧提供了直接證據。同時，PE患者胎盤組織中MAP4、α-tubulin、vinculin蛋白表達異常，可能