小鼠精原細(xì)胞與精母細(xì)胞miRNA差異表達(dá)及功能研究.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸,在物種間廣泛分布并高度保守的非編碼小分子RNA。miRNA通常以不完全互補(bǔ)方式識(shí)別結(jié)合mRNA的3’端非翻譯區(qū),進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。其作用形式包括介導(dǎo)靶mRNA降解或翻譯抑制?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miRNA參與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化及腫瘤形成等多種生物過(guò)程。miRNA在表達(dá)上具有時(shí)空特異性,該特點(diǎn)使其與發(fā)育及分化過(guò)程密切相關(guān)。
　　 精子發(fā)生是指精原細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞增殖、減數(shù)分裂及精

2、子細(xì)胞形成三個(gè)階段最終分化為單倍體成熟精子的周期性多級(jí)分化發(fā)育過(guò)程。以小鼠為例,其精原細(xì)胞首見(jiàn)于出生后第6天,約2天后出現(xiàn)B型精原細(xì)胞,并在第10天出現(xiàn)前細(xì)線期精母細(xì)胞,而圓形精子細(xì)胞的出現(xiàn)則需要20天,其第一波精子發(fā)生過(guò)程大約持續(xù)35天。
　　 眾所周知,發(fā)育過(guò)程涉及一系列轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控,而miRNA作為新涌現(xiàn)出來(lái)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子自發(fā)現(xiàn)以來(lái)倍受研究學(xué)者們的關(guān)注。近年來(lái),有關(guān)miRNA在精子發(fā)生中的作用已迅速成為男性

3、生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。例如,miR—122a主要在晚期生精細(xì)胞中表達(dá)并通過(guò)降解靶mRNA的方式抑制過(guò)渡蛋白2(TransitionProtein2,Tnp2)的表達(dá),而后者作為圓形精子細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志物參與減數(shù)分裂后期的染色質(zhì)重塑,提示miR-122a在減數(shù)分裂后期生精細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。最近的研究表明miR-34c可通過(guò)增強(qiáng)生精細(xì)胞特異標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)晚期精子發(fā)生。
　　 本實(shí)驗(yàn)室保有的兩個(gè)生精細(xì)胞系GC-1 spg和GC-2

4、 spd分別代表B型精原細(xì)胞及減數(shù)分裂前期精母細(xì)胞。兩者在精子發(fā)生中可視為減數(shù)分裂前的兩個(gè)連續(xù)的細(xì)胞分化時(shí)相,準(zhǔn)確地說(shuō)兩者處于由有絲分裂向減數(shù)分裂轉(zhuǎn)變的過(guò)渡階段。對(duì)其進(jìn)行表達(dá)譜分析可能有助于詮釋精子發(fā)生中減數(shù)分裂的發(fā)生機(jī)制。本研究中,我們通過(guò)miRNA芯片技術(shù)對(duì)GC-1與GC-2細(xì)胞中的miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析。分析數(shù)據(jù)結(jié)果并按GC-1/GC-2表達(dá)比值>2或<0.5篩選差異表達(dá)的miRNA,從中發(fā)現(xiàn)20個(gè)表達(dá)下調(diào)、8個(gè)表達(dá)上調(diào)的候選

5、miRNA。通過(guò)real time PCR法驗(yàn)證芯片結(jié)果,我們鑒定了4個(gè)GC-1細(xì)胞高表達(dá)的miRNA,分別是miR-15a、miR-125a-5p、miR—184及miR-468。
　　 應(yīng)用miRanda、TargetScan及PicTar等生物信息學(xué)軟件對(duì)上述候選miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行篩選,結(jié)果顯示在眾多預(yù)測(cè)靶基因中,僅miR-15a的一個(gè)潛在靶基因Ccnt2可以引起熒光素

6、酶活性的顯著降低。
　　 作為miR-15a/miR-16-1基因簇的一員,miR-15a一直被視為重要的腫瘤抑制因子,并通過(guò)特異性靶向各種致癌基因而與抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡及抑制腫瘤發(fā)生密切相關(guān),其表達(dá)下調(diào)見(jiàn)于多種癌癥。
　　 Cyclin T2(Ccnt2)是近十年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的T型Cyclin家族的一員,包含兩個(gè)選擇性剪接體(Cyclin T2a與Cyclin T2b),并在組織之間廣泛表達(dá)。Cyclin T2與CDK

7、9共同組成異源二聚體復(fù)合物P-TEFb(positive transcription elongation factor b)并通過(guò)磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,RNAPⅡ)羧基末端結(jié)構(gòu)域(carboxyl-terminal domain,CTD)進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄延伸。通常認(rèn)為,該復(fù)合物發(fā)揮作用并不依賴細(xì)胞周期進(jìn)程。目前,Ccnt2的功能尚不十分清楚,已明確的是其在肌細(xì)胞分化中具有重要意義。
　　 通過(guò)對(duì)8株

8、小鼠細(xì)胞系進(jìn)行Ccnt2及miR-15a的表達(dá)譜分析,我們發(fā)現(xiàn)兩者之間存在表達(dá)上的互反關(guān)系。對(duì)Ccnt2潛在靶位點(diǎn)的保守性分析顯示其在物種之間高度保守。為了驗(yàn)證miR-15a與Ccnt2之間的關(guān)系,我們對(duì)Ccnt2潛在靶位點(diǎn)進(jìn)行了突變體報(bào)告基因分析,結(jié)果顯示miR-15a可直接調(diào)控Ccnt2且位于miR-15a3’端的堿基配對(duì)對(duì)于其識(shí)別Ccnt2更加重要。此外,Western blot結(jié)果顯示應(yīng)用miR-15a模擬物(mimic)或抑制

9、物(inhibitor)轉(zhuǎn)染GC-1細(xì)胞可分別明顯降低或增加Ccnt2的表達(dá)量；進(jìn)一步的拯救實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ccnt2 siRNA可明顯抑制Ccnt2表達(dá),而此抑制作用可被miR-15a inhibitor恢復(fù),從而證明Ccnt2是miR—15a的直接靶基因。
　　 鑒于CDK9/Ccnt2復(fù)合物參與肌細(xì)胞分化過(guò)程,我們?cè)O(shè)想miR-15a可能參與調(diào)節(jié)該過(guò)程,并利用可誘導(dǎo)分化的小鼠成肌細(xì)胞模型C2C12進(jìn)行后續(xù)研究。利用miR-15a

10、 mimic或Ccnt2 siRNA轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞,real time PCR結(jié)果表明唯有miR-15a mimic處理組過(guò)表達(dá)miR-15a,且siRNA與miR-15a均可使Ccnt2 mRNA表達(dá)降低,提示miR-15a通過(guò)降解途徑抑制Ccnt2表達(dá)。之后對(duì)轉(zhuǎn)染miR-15a的C2C12細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化,并在不同時(shí)間點(diǎn)上觀察早期分化標(biāo)志物(myogenin)及晚期分化標(biāo)志物(myosin heavy chain,MHC)的表達(dá)

11、變化。結(jié)果顯示隨著分化進(jìn)程,myogenin及MHC的表達(dá)量均連續(xù)增加,而Ccnt2的表達(dá)量卻逐漸降低,提示Ccnt2對(duì)細(xì)胞分化的起始階段有重要作用。與對(duì)照組相比,miR-15a處理組中myogenin及MHC的表達(dá)量均減少;而從細(xì)胞形態(tài)上看,miR-15a對(duì)肌管形成有明顯抑制作用。由此可見(jiàn),miR-15a通過(guò)靶向Ccnt2進(jìn)而對(duì)成肌細(xì)胞的分化起負(fù)調(diào)控作用。
　　 由于缺乏生精細(xì)胞分化的體外模型,難以直接觀察到Ccnt2及miR

12、-15a對(duì)生精細(xì)胞分化的影響,因而我們收集發(fā)育中的小鼠睪丸,并在不同水平上對(duì)兩者的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。Real time PCR結(jié)果顯示,Ccnt2 mRNA在出生后3周內(nèi)連續(xù)增加并在第4周突然降低,提示其對(duì)早期精子發(fā)生意義重大.而Western blot結(jié)果顯示,Ccnt2較大的剪接體(小鼠的Cyclin T2a)在第3周時(shí)表達(dá)量突然升高,隨后基本穩(wěn)定;而較小的剪接體(小鼠的Cyclin T2b)則在第3周時(shí)表達(dá)量突然降低,之后變化也不

13、大,提示Ccnt2的兩個(gè)剪接體在睪丸發(fā)育的不同階段分別發(fā)揮主要作用。對(duì)miR-15a的平行檢測(cè)表明,miR-15a在出生后,尤其是出生后3周內(nèi)連續(xù)降低,在表達(dá)上與Ccnt2恰好相反。因此,Ccnt2與miR-15a可能在早期精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用。
　　 綜上所述,我們鑒定了4個(gè)在小鼠減數(shù)分裂前生精細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA,預(yù)測(cè)并證實(shí)Ccnt2是miR-15a的一個(gè)直接靶基因。同時(shí),我們首次報(bào)道m(xù)iR-15a通過(guò)靶向Ccnt2