CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)肝癌特異性CTL殺傷活性的影響.pdf

1、目的： 觀察肝癌特異性CTL對(duì)肝癌細(xì)胞的特異性殺傷作用，觀察Treg對(duì)肝癌特異性CTL殺傷活性的影響，探討Treg在腫瘤免疫及DC疫苗治療中的所起的作用。 方法： 1.取小鼠雙側(cè)股骨，分離并培養(yǎng)獲得DC，在H22全細(xì)胞性抗原致敏后，與脾淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，使其分化、增殖為肝癌抗原特異性CTL。 2.取小鼠脾淋巴細(xì)胞，免疫磁珠法分離獲得Treg。 3.分別以H22細(xì)胞和8226細(xì)胞為靶細(xì)胞，設(shè)肝癌抗原

2、特異性CTL為效應(yīng)細(xì)胞，設(shè)未經(jīng)H22全細(xì)胞性抗原致敏DC激活的脾淋巴細(xì)胞為對(duì)照組效應(yīng)細(xì)胞，分別在效靶比為10:1、20:1、40:1觀察效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。 4.根據(jù)上步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最佳的效靶比，觀察Treg不同濃度下對(duì)肝癌特異性CTL殺傷活性的影響，按Treg的不同濃度(0.0×104/ml、1.0×104/ml、2.0×104/ml、5.0×104/ml、1.0×105/ml、2.0×105/ml)分為六組。

3、 殺傷活性的測(cè)定采用CCK-8，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處吸收值(A值)。公式如下：殺傷活性(％)=[單純靶細(xì)胞組A值-空白孔的A值-(實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战MA值-效應(yīng)細(xì)胞組A值)]/(單純靶細(xì)胞組A值-空白孔的A值)×100％。 結(jié)果： 1.免疫磁珠法分離獲得的Treg經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定CD4與CD25雙陽性率達(dá)99％以上。 2.肝癌抗原特異性CTL具有很強(qiáng)的對(duì)H22肝癌細(xì)胞的殺傷活性[在效靶比為10:1、20:1、40

4、:1的殺傷率分別(25.3±3.2)％，(38.1±4.6)％，(54.4±4.1)％]，明顯高于其對(duì)8226細(xì)胞的殺傷活性[在效靶比為10:1、20:1、40:1的殺傷率分別(11.3±2.6)％，(13.5±3.1)％，(14.2±3.5)％]，也明顯高于未經(jīng)抗原致敏DC刺激的脾淋巴細(xì)胞對(duì)H22肝癌細(xì)胞的殺傷活性[在效靶比為10:1、20:1、40:1的殺傷率分別(10.3±2.6)％，(12.5±3.1)％，(14.8±2.9)％

5、]。 3.選擇肝癌抗原特異性CTL與H22肝癌細(xì)胞的效靶比為40:1，加入不同濃度Treg后，對(duì)CTL殺傷活性均有不同程度的抑制，并且隨Treg的濃度增高，抑制效果越加明顯。但到5.0×105個(gè)/ml以后，再增加Treg濃度，其抑制效果未見明顯增加。在加入Treg的濃度為0.0×104/ml、1.0×104/ml、2.0×104/ml、5.0×104/ml、1.0×105/ml、2.0×105/ml后，其殺傷率分別為(55.3±