蘚化飲治療金黃地鼠頰黏膜癌前病變前后HSP90α、Ki-67的表達及意義.pdf

1、目的：口腔黏膜癌前病變是發(fā)生口腔癌的潛在惡性病變，近年來有發(fā)病率上升的趨勢，及時的預防和治療口腔黏膜癌前病變顯得尤為重要?？谇徽衬ぐ┣安∽兊牟∫蝈e綜復雜，癌變機理尚待明確。近年來隨著腫瘤分子生物學研究的不斷深入，口腔黏膜癌前病變發(fā)病機理研究取得一定進展。目前，研究主要集中在口腔黏膜癌前病變與細胞凋亡及增殖、周期調(diào)控紊亂關(guān)系的研究上。Ki67抗原是與細胞周期密切相關(guān)的增殖細胞核蛋白。Ki67高表達是細胞增殖活躍的重要標志。HSP90α受體

2、蛋白與信號轉(zhuǎn)導、細胞周期調(diào)控和凋亡路徑有關(guān)，在腫瘤細胞中過度表達，不僅對腫瘤細胞的保護、維持細胞的穩(wěn)定有重要的作用，而且在抑制腫瘤細胞凋亡的過程中也發(fā)揮著重要的作用。HSP90α和Ki-67的表達可以作為癌前病變的早期診斷和用來作為對藥物治療癌前病變療效評定的生物學指標。
　　 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)中藥治療口腔黏膜癌前病變顯示出明顯的優(yōu)勢。我們在以往的臨床實踐中應用中藥蘚化飲治療口腔黏膜癌前病變收到較好的治疔效果。為了深入研究

3、中藥蘚化飲的確切作用機制，本實驗通過建立金黃地鼠頰黏膜癌前病變動物模型，采用免疫組化方法觀察中藥蘚化飲治療金黃地鼠頰黏膜癌前病變前后HSP90α、Ki-67的表達，分析探討中藥蘚化飲對口腔黏膜癌前病的逆轉(zhuǎn)作用，為今后臨床應用提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1建立動物頰黏膜癌前病變模型選取SPF級LVG敘利亞金黃地鼠55只，鼠齡六周，體質(zhì)量80g。按完全隨機設計方法將動物分為：空白對照組5只和實驗組50只。實驗組用于建

4、立口腔黏膜癌前病變動物模型，其中又分為癌前病變對照組10只、蘚化飲治療組30只、生理鹽水治療對照組10只。空白對照組不做任何處理，直至實驗結(jié)束，與其余組一同處死。將實驗組50只動物，頰囊黏膜涂以0.5％DMBA丙酮溶液，涂藥后禁食禁水2小時，每周3次，連續(xù)涂藥6周。癌前病變對照組、蘚化飲治療組、生理鹽水治療對照組分別涂致癌劑6周后正常飼養(yǎng)、中藥蘚化飲灌胃、生理鹽水灌胃治療8周后處死。
　　 2動物標本取材1％戊巴比妥鈉溶液腹腔注

5、射處死動物后立即取材，取材部位選擇在頰囊前外側(cè)、雙側(cè)頰囊黏膜分別切取約1.0cm×1.5cm×0.1cm大小病變組織及相鄰的部分正常組織。標本10％甲醛溶液固定。
　　 3免疫組化染色法檢測各組中HSP90α、Ki-67的表達根據(jù)SP免疫組化染色試劑盒說明進行。以PBS代替第一抗體的正?？谇火つど掀そM織免疫組化染色結(jié)果作陰性對照。用免疫組化染色法檢測各組中HSP90α、Ki-67的表達情況，并分析對比各組之間的差異。Ki67染色

6、評估以細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標準，HSP90α染色評估以細胞核或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標準。采用半定量積分法，將染色強度分為4級：無著色計為0分；淡黃色計為1分；棕黃色計為2分：棕褐色計為3分。按陽性細胞的百分比分5級：小于5％計為0分；5％-25％計為1分；26％-50％計為2分；51％-75％計為3分；大于75％計為4分。每張切片最后的得分為兩次評分相加所得的總分，按照：0-1分計為(-)；2-3分計為(+)；4-5分計為(

7、++)；6-7分計為（++）。以（-）定位陰性，以(+)、(++)、（+++）分別定位弱陽性、陽性和強陽性。
　　 所有資料應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.空白對照組地鼠頰囊黏膜表面光滑.呈淡粉色，透亮具有彈性，血管清晰，鏡下觀察為角化的復層鱗狀上皮，上皮和肌層之間為薄層結(jié)締組織及少量散在的纖維細胞和血管。DMBA丙酮溶液六周后，實驗組50只動物雙

8、側(cè)頰黏膜肉眼觀全部為充血、糜爛、條索狀皺折等表現(xiàn)。隨機切取10例不同肉眼表現(xiàn)的部分病變部位，HE染色后鏡下觀察地鼠頰黏膜可見不同程度的異常增生，表現(xiàn)為上皮結(jié)構(gòu)異常，上皮分層不規(guī)則，基底細胞極性喪失，滴狀釘突，核分裂數(shù)增加，異常的淺層分裂，單個細胞成熟前角化（錯角化）及釘突內(nèi)出現(xiàn)角化珠等。說明經(jīng)DMBA丙酮溶液致癌六周后，已成功建立金黃地鼠頰黏膜癌前病變的動物模型。
　　 2.蘚化飲治療后HSP90α、Ki-67在各組免疫組化染色

9、結(jié)果HSP90α陽性表達在細胞核或細胞漿，呈棕黃色顆粒狀。Ki-67陽性表達主要在細胞核，呈棕黃色顆粒狀。癌前病變對照組HSP90α、Ki-67的表達高于空白對照組，有顯著性差異(P＜0.05)；癌前病變對照組HSP90α、Ki-67的表達高于蘚化飲治療組，有顯著性差異(P＜0.05)；生理鹽水治療對照組HSP90α、Ki-67的表達高于蘚化飲治療組，有顯著性差異(P＜0.05)；而蘚化飲治療組HSP90α、Ki-67表達率與空白對照組

10、，無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 統(tǒng)計學分析，兩指標表達具有相關(guān)性，表達吻合度具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.應用DMBA成功建立金黃地鼠頰黏膜癌前病變動物模型2.HSP90α、Ki-67在正?？谇火つび猩倭勘磉_，在口腔黏膜癌前病變組織中明顯表達。應用中藥蘚化飲對口腔黏膜癌前病變進行治療干預后，HSP90α、Ki-67的表達較治療前降低。
　　 3.中藥蘚化飲對DMBA誘發(fā)的金黃地鼠口腔黏