旁分泌機制在脂肪間充質(zhì)干細胞移植治療心肌梗死中的作用.pdf

1、心血管疾病是目前人類死亡的主要原因之一,目前我國人群心血管病的患病率處于持續(xù)上升階段[1]。心肌僅有有限的自我再生能力[2],目前的藥物或介入等臨床治療方法只能延緩心力衰竭的發(fā)展[3]。干細胞移植已成為治療心肌梗死的新策略[4]。近年來的研究證明干細胞治療可以顯著改善心室重構(gòu)和提高心功能(包括左室收縮功能、舒張功能和冠脈血流儲備等)[5,6]。干細胞對心肌梗死(myocardialinfarction,MI)的治療作用主要包括兩個機制,

2、即直接分化和旁分泌作用。一些研究提示間充質(zhì)干細胞可以在體外誘導(dǎo)環(huán)境下和在體移植后分化為心肌細胞和血管細胞,實現(xiàn)一定程度上的心肌再生。但另一些研究認為間充質(zhì)干細胞不能分化為心肌細胞和血管細胞,其治療功能完全是旁分泌作用[7,8]——通過釋放旁分泌因子到周圍組織,發(fā)揮保護作用。但是,直接分化和旁分泌作用在干細胞對心肌梗死治療中的具體機制及其各自所貢獻比重尚不清楚[9,10]。
　　脂肪間充質(zhì)干細胞(Adipose-derivedMes

3、enchymalStemCells,ADSC)因易大量獲取、較強增殖能力和多向分化潛能,加之免疫原性低的優(yōu)勢,被認為是治療心臟病的理想干細胞來源;且新鮮分離的人ADSC的數(shù)量足以達到臨床治療的細胞數(shù)量,故不需在體外擴增即可用于自體移植,臨床意義重大[11]。ADSC對心肌梗死的治療作用明顯優(yōu)于骨髓來源的干細胞[8]。直接分化和旁分泌作用在ADSC治療心肌梗死中的作用機制未見報道。最近的研究發(fā)現(xiàn)ADSC條件培養(yǎng)液(conditionedm

4、edium,CM)促進內(nèi)皮細胞的存活和遷移而影響血管新生[14]。但這些研究均局限于細胞實驗,ADSC-CM與ADSC是否對心肌梗死具有同等的治療作用尚不清楚。ADSC-CM能否在動物實驗中保護心肌組織和促進血管新生亦未見報道。本研究比較了ADSC-CM與ADSC對小鼠心肌梗死的治療效果,評估了旁分泌機制在ADSC治療中的作用,探討了ADSC的旁分泌抗心肌細胞凋亡作用及其機制,并比較了移植后ADSC的直接分化和旁分泌作用在心肌梗死治療作

5、用中的貢獻比重。
　　方法:
　　原代分離和培養(yǎng)人ADSC,將經(jīng)鑒定的第3~5代的ADSC用于實驗。
　　1.用8~10周齡(20~24g)的雄性C57B/L小鼠,結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立心肌梗死(myocardialinfarction,MI)損傷模型,實驗分假手術(shù)組,MI+DMEM組、MI+ADSC-CM組和MI+ADSC組(N=12)。在MI處理的小鼠心肌梗死邊緣區(qū)分別注射DMEM、ADSC-CM或者ADSC,通

6、過觀察動物生存率、TTC染色測量心肌梗死面積、超聲評價心功能變化、TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡等,評價各種處理對心肌梗死的治療效果。
　　2.用H2O2建立大鼠乳鼠心肌細胞(neonatalratventricularmyocytes,NRVM)體外損傷模型,觀察ADSC-CM對心肌細胞的保護作用。實驗分DMEM組,H2O2+DMEM組和H2O2+ADSC-CM組(N=5)。用caspase-3蛋白表達定量和TUNEL染色檢測心

7、肌細胞凋亡。
　　結(jié)果:
　　1.DMEM組存活率為66.7％,ADSC-CM組存活率為70.0%,ADSC組存活率為72.7%。三個組生存率無組間統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),提示ADSC-CM或者ADSC心肌內(nèi)注射不能提高MI小鼠的存活率。
　　2.與DMEM組相比,ADSC和ADSC-CM心肌內(nèi)注射均能減少梗死面積,但ADSC組和ADSC-CM組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(DMEM:41.9±3.0%;ADSC:32.2±

8、2.8%;ADSC-CM:35.7±2.5%)。
　　3.術(shù)后4周超聲結(jié)果顯示,假手術(shù)組小鼠心功能前后無明顯變化,DMEM組小鼠心梗后(EF:43.8±3.7%,FS:19.0±3.8%)較假手術(shù)組(EF:90.8±5.4%,FS:45.6±6.8%)明顯降低。心肌內(nèi)注射ADSC-CM(EF:60.4±5.8%,FS:27.6±3.5%)較DMEM明顯提高心功能。ADSC組(EF:69.2±4.3%;FS:34.3±2.5%)較A

9、DSC-CM組進一步提高心功能。
　　4.MI手術(shù)后4周的梗死邊緣區(qū)的血管新生。ADSC組和ADSC-CM組的毛細血管密度明顯高于DMEM組。但ADSC組和ADSC-CM組間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　5.在心肌細胞損傷模型中,H2O2誘導(dǎo)組caspase-3蛋白表達較DMEM組明顯升高,ADSC-CM預(yù)處理可明顯降低caspase-3的表達。同時TUNEL染色亦顯示:ADSC-CM預(yù)處理可明顯減少NRVM的TUNEL陽性率。

10、>　　6.TUNEL染色檢測MI后2天梗死邊緣區(qū)的心肌細胞凋亡。ADSC-CM組和ADSC組的心肌細胞TUNEL陽性率較DMEM組明顯減少,而ADSC-CM組和ADSC組間相比無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　7.MI后4周,可以檢測到移植存活的ADSC。ADSC不表達心肌細胞標志物Tropomyosin和a-actinin;部分ADSC可表達內(nèi)皮細胞標志物vWF和平滑肌細胞標志物SMA。
　　8.MI后4周,ADSC-CM或ADSC均促

11、進梗死邊緣血管新生。ADSC組血管新生密度較DMEM組增加64.3%。CD31+和GFP+雙陽性的細胞(ADSC直接分化的血管細胞)占新生血管總量的3.4±0.7%。直接分化在ADSC對心肌梗死治療作用的貢獻很小(小于10%),而旁分泌機制起主導(dǎo)作用(大于90%)。
　　結(jié)論:
　　ADSC-CM心肌內(nèi)注射可減小心梗面積和改善心功能,起到與ADSC移植類似的治療效果。ADSC在心肌內(nèi)可分化為血管細胞參與血管新生,但直接分化對