同種異體骨髓間充質干細胞移植治療急性心肌梗死的實驗研究.pdf

1、背景 目前看來，冠心病的發(fā)病率逐年增加，其直接的后果是心肌供血減少導致細胞死亡或功能受損，從而產(chǎn)生心功能損害，嚴重時造成心力衰竭。 干細胞是一族具有自我復制和多向分化能力的細胞。已有許多的臨床前期試驗表明干細胞治療可能通過修復或再生受損心肌，增強血管新生等作用，縮小心肌梗死的面積，改善心功能。最近研究將某些類型的干細胞通過細胞移植的方法種植到病變區(qū)域，使其增生分化為心肌細胞和/或血管內皮細胞，從而增加和恢復具有完善收

2、縮功能的心肌細胞數(shù)目，逆轉心室重塑，取得了鼓舞人心的成就。 雖然干細胞移植治療缺血性心臟病已成為新的研究熱點，但也存在不少問題，如：移植干細胞的類型、移植方法、移植時間的選擇等等。本研究從以下兩個大的方面展開：(1)骨髓干細胞能否在梗死心肌內存活并且分化成為新的心肌細胞從而改善心功能?(2)缺血/再灌注后移植干細胞有否良好作用。 目的： (1)建立心肌梗死及缺血/再灌注模型；(2)觀察骨髓間充質干細胞培養(yǎng)、

3、制備的過程及方法：(3)探討骨髓間充質干細胞移植的方法、時機； (4)觀察標記的骨髓干細胞能否在梗死及再灌注心肌內存活并且分化成為新的心肌細胞；(5)觀察骨髓干細胞移植對心功能改善及減輕再灌注損傷的作用。 方法： 1．骨髓間充質干細胞(MSCs)的制備及細胞標記用離心的方法分離出大白鼠的股骨骨髓，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，經(jīng)沖洗后，培養(yǎng)、傳代，得到第三代骨髓間充質干細胞(P3)，于培養(yǎng)液中加入終濃度為50ug/m

4、l的4,6二乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)，孵育，然后用Hanks平衡鹽液洗去未結合的DAPI。利用熒光顯微鏡觀察計數(shù)同一個視野細胞核發(fā)出藍色熒光的細胞數(shù)目，每個標本隨機計數(shù)lO個高倍視野取其平均值，計算二者的比值即得到DAPI的標記率。 2．急性心肌梗死(AMI)和缺血/再灌注(CIR)動物模型的制備將大白鼠充分麻醉后，固定、備皮、鋪單，在心電監(jiān)護和呼吸輔助的條件下，取胸骨正中切口，暴露心臟，以左心耳與肺動脈圓錐間的左冠狀

5、靜脈主干為標志結扎左冠狀動脈前降支(缺血/再灌注動物模型結扎時絲線與心外膜之間放置一塑料軟管)，觀察前壁部分區(qū)域顏色變淺及心電圖有梗死改變即為AMI模型，抽出塑料軟管即為CIR模型。 3細胞移植：將動物模型再次開胸，充分暴露心臟，把干細胞懸液以點注射的方式局部注射入梗死灶的周邊區(qū)，并以縫線標記注射點后關胸。 4．超聲心動圖檢測心功能： 選擇切面包括：心尖四腔、兩腔切面，左室長軸和短軸切面。測定參數(shù)包括：左室射血

6、分數(shù)、左室短軸縮短率、左室舒張末期直徑、左室收縮末期直徑、左室舒張末期前壁厚度、左室收縮末期前壁厚度、左室舒張末期后壁厚度、左室收縮末期后壁厚度、主動脈血流速度、心率。 5．免疫熒光檢查干細胞向心肌細胞的分化過量麻醉處死實驗動物，迅速取出心臟，取縫線標記處的心肌制成8um厚的連續(xù)冰凍切片標本，加入抗心肌a肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain，a-MHO)作為一抗，然后滴加異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗鼠

7、IgG作為二抗，進行激光共聚焦顯微鏡檢查，檢測DAPI示蹤的細胞是否具有心肌細胞特異性標記抗α-肌球蛋白重鏈。DAPI測試參數(shù)：紫外光(UV)激發(fā)，Ex/Em：356nm/BP461，針孔：1.0；FITC測試參數(shù)：Argon激光，Ex/Em：488nm/BP505-550，針孔：1.0。 6.HE常規(guī)染色觀察 完整取出心臟，將房室溝以上部分完全剪去，觀察外形。然后將心肌置于10％福爾馬林內浸泡固定24小時以上，1周內

8、取出標本，進行脫水、透明、浸蠟和包埋，制成蠟塊備用。切成4Um厚的切片，固定于多聚賴氨酸處理的防脫載玻片上。石蠟切片，常規(guī)脫蠟，置入Harris蘇木素液5分鐘左右，水洗1分鐘，75％鹽酸乙醇分化30秒，水洗，氨水處理30秒，水洗1分鐘，酸化伊紅乙醇液染12分鐘，自來水快速沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明后中性樹膠封固。在BH2型OLYMPUS照像顯微鏡下，以100～400放大倍率，觀察心肌組織結構變化并選取典型視野照相。 7.用

9、左心導管檢查心功能充分麻醉大鼠，固定分離右側頸總動脈，插入內充肝素生理鹽水的塑料管至左室腔，用多導生理記錄儀描記左室縮．舒壓差(LVEDP)、左室等容收縮/舒張期壓力上升或下降最大速率(±LVdp/dtmax)以反映左室收縮與舒張功能．所有電信號均用計算機軟件分析處理。 8梗死區(qū)心肌SOD和MDA水平測定采用過量戊巴比妥腹腔注射(100mg/Kg)處死，取出梗死區(qū)心肌組織約0.2g用生理鹽水沖洗干凈，眼科剪刀剪碎，置組織粉碎機上

10、粉碎研磨至糊狀，用生理鹽水配置成10％、1％的組織勻漿分別離心取上清，嚴格按照操作表進行操作。 9．統(tǒng)計學分析 本研究計量資料用x±s表示，所有分析均用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包完成，對計量資料采用小樣本t檢驗，包括配對設計資料的t檢驗和成組設計資料的t檢驗。統(tǒng)計結果以P≤0.05為有顯著意義。 結果： 1．標記的骨髓干細胞在梗死心肌內存留并且分化為心肌樣細胞骨髓干細胞植入梗死心肌后4周，實驗組動物的梗死

11、心肌冰凍切片內，激光共聚焦顯微鏡下可見DAPI標記的細胞核呈藍色，這些細胞播散并遷移至整個梗死區(qū)域，正常心肌內未見浸潤。合成紫外光(UV)激發(fā)和Argon激光激發(fā)的兩種熒光細胞圖像，可見細胞切面圖：DAPI示蹤的細胞核呈現(xiàn)藍色熒光，a-MHC抗體陽性的細胞漿呈現(xiàn)綠色熒光。 2．多功能超聲心動圖檢查心功能本研究采用隨機分組，因此在基礎狀態(tài)下兩組大白鼠在術前所測LVDd、LVDs、LVFTd、LVFTs、EF、FS等心功能各項主要的

12、指標均無顯著性差異。心肌的厚度、活動度及回聲均無異常。在再次開胸注射骨髓干細胞/培養(yǎng)基后兩周，兩組動物左室內徑出現(xiàn)擴大，EF及FS下降，并且兩組相比沒有顯著性差異。二維超聲在兩組均發(fā)現(xiàn)前壁部分區(qū)域運動減弱、厚度變薄及回聲增強，后壁代償性運動增強、心肌略有增厚。于注射后4周開始，對照組左室內徑繼續(xù)增大，EF及FS顯著下降，后壁代償?shù)某潭雀用黠@，二維切面上可以看到前壁部分區(qū)域有運動消失現(xiàn)象，部分可見巨大的室壁瘤形成。在細胞移植組，擴大的左

13、室內徑開始減小，EF及FS改善，同對照組相比有顯著性差異，二維超聲沒有發(fā)現(xiàn)運動消失及室壁瘤形成。 3．蘇木素一伊紅(HE)常規(guī)染色于注射后2周開始觀察，對照組心肌細胞基本結構紊亂，核固縮明顯，染色加深，甚至溶解消失，發(fā)生灶性分布的玻璃樣變性，肌纖維斷裂，膠原增生，心肌組織逐漸被癱痕組織替代，未發(fā)現(xiàn)核漿比例大的細胞。在實驗組細胞移植區(qū)域，可見炎癥細胞浸潤，出現(xiàn)核漿比例較大、類似胎心或新生心室細胞的細胞，生長排列方向與肌纖維一致，

14、心肌細胞的纖維化被有效抑制，瘢痕組織形成較少見。 4．梗死區(qū)植入細胞的免疫熒光檢查細胞移植2周后，熒光顯微鏡顯示，所有干細胞移植組梗死區(qū)心肌組織標本中均可見DAPI標記的藍色熒光供體細胞核，分布比較廣泛，呈橢圓形，似心肌細胞核，并與心肌纖維排列方向一致，在藍色背景下細胞核深染，與其他細胞成分對比清楚；Argon激光激發(fā)條件下，心肌細胞胞漿呈綠色熒光。而在對照組，沒有發(fā)現(xiàn)有DAPI標記的藍色熒光細胞核及綠色細胞胞漿。 5．

15、左心導管檢測心功能CIRI對照組和CIRI移植組左室收縮壓、左室壓最大上升速率均較假手術組明顯降低，而左室舒張壓、左室壓最大下降速率均較假手術組明顯升高(P≤0.01)；，CIRI移植組左室收縮壓、左室壓最大上升速率較CIRI對照組升高而左室舒張壓、左室壓最大下降速率較對照組下降(P≤0.01)。 6．心肌組織SOD及MDA檢測結果 與假手術組相比，CIRI對照組及CIRI移植組梗死區(qū)心肌組織中SOD活力明顯降低，MDA產(chǎn)生明

16、顯增多(P≤0.01)；CIRI移植組與CIRI對照組相比，SOD下降程度小，MDA產(chǎn)生的數(shù)量少(P≤0.01)。 結論 (1)經(jīng)心外膜注射移植骨髓間充質干細胞是可行的。在本研究所做的動物實驗中，將操作方法略做改進，AMI模型動物經(jīng)注射干細胞后，均獲得存活，無一例出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥。 (2)骨髓間充質干細胞移植治療對AMI后心肌的修復及心功能的改善效果確切。經(jīng)多重指標檢測發(fā)現(xiàn)，梗死區(qū)有新生細胞生長，心功能各項參數(shù)明顯

17、改善。 (3)在AMI后1周移植干細胞效果好。在本研究中是在發(fā)生AMI后1周移植，效果良好，其他時間如：AMI后即刻，AMI再通后，AMI后2周或更長時間是否可行還有必要進行進一步研究。 (4)干細胞移植較安全。移植后連續(xù)觀察12周沒有發(fā)生嚴重的并發(fā)癥，心肌上沒有形成其他異常組織。 (5)移植干細胞修復心肌及改善心功能的機制，本研究中沒有進行探討?，F(xiàn)在存在很多觀點，大多數(shù)的研究認為其能增加心肌細胞及微血管的數(shù)量。