姜黃素和維甲酸抵制人視網膜色素上皮細胞移行和重塑人視網膜色素上皮細胞外基質的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、增殖性玻璃體視網膜病變(proliferativevitreoretinopathy,PVR)是在玻璃體和視網膜前后表面形成纖維增殖膜,由于膜的收縮和牽拉引起視網膜脫離(retinaldetachment,RD)為特征的一類眼病。PVR是孔源性視網膜脫離最嚴重的并發(fā)癥之一,其發(fā)展過程包括早期的細胞移行,細胞增殖,細胞外基質的重塑和纖維細胞膜的形成和收縮,引起視網膜結構明顯的變形,造成視網膜復位手術的失敗,最終導致嚴重的視功能喪失或失明。

2、PVR也是嚴重眼外傷、血管性視網膜病變的常見并發(fā)癥。視網膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)細胞作為最關鍵細胞,貫穿于PVR發(fā)生、發(fā)展的所有過程。PVR病理上分為三個階段:第一階段RPE等細胞移行至視網膜前和視網膜下,開始增殖;第二階段包括RPE等細胞大量增殖和細胞外基質的重塑;最后階段纖維增殖膜形成并收縮導致RD。過多地纖維細胞膜的增殖被認為是伴隨RPE細胞參與和細胞外基質重塑的一種創(chuàng)傷修復過程。一旦

3、孔源性視網膜脫離中的RPE細胞從基底膜上播散下來,它的性質就變得像體外培養(yǎng)的成纖維母細胞一樣活躍。
   臨床上一直沿用的治療PVR的方法是玻璃體視網膜手術,手術技術的飛速發(fā)展提高了視網膜復位率,但術后往往由于再次發(fā)生PVR,導致RD復發(fā),嚴重影響患者視功能。因此,選擇安全有效的藥物早期防治PVR是一項既迫切又有廣泛前景的任務?,F在,無論在臨床上還是動物實驗中,藥物防治PVR日益成為研究的熱點。迄今為止眼科界所研究用于PVR的藥

4、物不下幾十種,這些藥物主要為西藥,雖然抗增殖作用強大,但作用單一,且可能存在一定細胞毒性,一直未能應用于臨床。中藥具有藥源豐富、作用多樣且毒副作用小等眾多優(yōu)點,從理論上有很好的應用前景。一種從植物中提取的天然中藥姜黃素進入我們視線。姜黃素是從植物姜黃(Curcumalonga)中提取的一種天然有效成分。它具有抗癌性、抗炎性、抗血管化、抗氧化、抗風濕和抗轉移等多種功效,在內科及抗腫瘤疾病中研究頗多,但是在眼科領域國內外報道為數不多。同時,

5、近年來的實驗研究多限于針對RPE細胞自身增殖的研究,對于RPE和其生物活性息息相關的微環(huán)境----細胞外基質的相關特性目前還不十分明確或者報道的較片面。
   因此,本課題分別通過體外和體內實驗研究姜黃素這種中藥對人砌)E細胞移行的抑制作用和對人RPE細胞外基質的重塑的影響,并選取了先前研究中防治PVR效果顯著的藥物----維甲酸作為對照研究。積極從細胞外基質方面,探討姜黃素和維甲酸這兩種藥物如何來阻止RPE細胞產生PVR的行為

6、,為PVR防治提供新思路。
   第一部分,姜黃素和維甲酸抑制人視網膜色素上皮細胞移行的體外和體內實驗研究
   目的:研究不同劑量的姜黃素和維甲酸對體外培養(yǎng)的人RPE細胞移行的影響,評價姜黃素和維甲酸在人RPE細胞移行中的作用,并篩選出這兩種藥物抑制人RPE細胞移行的最佳藥物濃度。將最佳濃度的姜黃素和維甲酸分別作用于RPE細胞誘導的兔眼PVR模型,評價兩種藥物對RPE細胞在體內侵襲能力的影響。
   方法:采用

7、胰蛋白酶消化法體外分離、培養(yǎng)人RPE細胞,免疫熒光細胞化學法進行細胞鑒定。取第4~6代生長狀態(tài)良好的RPE細胞用于實驗。以MTT法檢測不同濃度姜黃素(0、0.25×10-5、0.5×10-5、1.0×10-5、2.0×10-5、4.0×10-5M)和不同濃度維甲酸(0、10-6、10-5、10-4、10-3M)作用48h后對人RPE細胞增殖的影響。通過計算48h作用時間后姜黃素和維甲酸的半數抑制率(thehalfmaximalinhib

8、itoryconcentration,IC50)。篩選合適濃度的姜黃素和維甲酸作用人RPE細胞,分別通過劃痕實驗,transwell侵襲實驗,3D膠原膠收縮實驗和體內RPE細胞的侵襲實驗,探討姜黃素和維甲酸在人RPE細胞移行中的作用。
   結果:初分離的人RPE細胞呈球形,多數細胞胞質中布滿黑色素顆粒,在培養(yǎng)48~72h內貼壁,培養(yǎng)后7d細胞達融合,傳代細胞24h貼壁。傳至第4代細胞黑色素顆粒明顯減少,免疫細胞熒光化學染色法提

9、示細胞S-100抗原和角蛋白(cytokeratinAE1/AE3)抗原均表達陽性。姜黃素和維甲酸的IC50分別是:1.2×10-5M和10-2.77M。
   劃痕實驗中:0、10-6、10-5和10-4M的維甲酸和0、0.25×10-5、0.5×10-5、1.0×10-5M的姜黃素分別作用于人RPE細胞,維甲酸和姜黃素對細胞的遷移均有抑制作用,且呈濃度依賴性;transwell細胞侵襲實驗中:0、10-6和10-5M的維甲酸

10、和0、0.25×10-5和0.5×10-5的姜黃素分別作用于人RPE細胞48h,維甲酸和姜黃素對細胞的侵襲均有抑制作用,且呈濃度依賴性;3D膠原膠收縮實驗中:0、10-6和10-5M的維甲酸和0、0.25×10-5和0.5×10-5的姜黃素分別被加入含有2×105RPE的膠原膠的混合物中,連續(xù)觀察96h,維甲酸和姜黃素對膠原膠的收縮均有抑制作用,且呈濃度依賴性;RPE細胞體內侵襲實驗中:0、0.5×10-5M姜黃素和10-5M維甲酸各1

11、00μl和100μl含2×106第6代RPE混合液(共200μl)分別注入兔眼玻璃體腔,連續(xù)觀察4周。與對照組比較,姜黃素和維甲酸能顯著地抑制PVR的形成。
   結論:通過體外培養(yǎng)的方法可獲得大量人RPE細胞,用于體外和體內實驗研究;結合MTT實驗、劃痕實驗、transwell侵襲實驗、3D膠原膠的收縮模擬實驗和RPE細胞體內侵襲實驗數據,0.5×10-5M的姜黃素和10-5M的維甲酸對體外培養(yǎng)和注入兔眼內的人RPE細胞的移行

12、能力有顯著地抑制作用,并且48h的時間觀察點被作為合適的實驗條件確定下來,將應用于進一步的實驗。
   第二部分,姜黃素和維甲酸對體外培養(yǎng)的人視網膜色素上皮細胞外基質和粘附分子mRNA水平的影響
   目的:通過觀察姜黃素和維甲酸對體外和體內人RPE細胞移行的影響,應用基因芯片和實時定量PCR(real-timePCR)檢測姜黃素和維甲酸對人RPE細胞外基質和粘附分子mRNA表達的影響,探討姜黃素和維甲酸影響人RPE細胞

13、外基質重塑的因素及作用機制。
   方法:選取第9代生長狀態(tài)良好的人RPE細胞用于本研究。通過人的細胞外基質和粘附分子PCR芯片技術描述0.5×10-5M的姜黃素和10-5M的維甲酸干預后人RPE(1×107)48h后細胞外基質和粘附分子基因表達圖譜。并與不加任何藥物的空白對照組進行比較。
   結果:與對照組比較,84個被檢測的基因中,與姜黃素相關的17個基因的mRNA顯著下調,10個顯著增加(P<0.05);與維甲酸

14、相關的有24個基因,其中20個基因的mRNA顯著下調,4個顯著增加(P<0.05)。
   結論:姜黃素和維甲酸對人RPE細胞外基質和粘附分子的mRNA的表達影響是顯著的,有選擇性的,并有類似的作用機制。這兩種藥物共同抑制基質金屬蛋白酶(MatrixMetalloPreteinases,MMP),如MMP1,MMP2,MMP9;大多數的膠原蛋白;纖粘連接蛋白1(Fibronectin1)和層粘連蛋白等;共同增強MMP3和一些整合

15、素的表達。相比較而言,在調節(jié)MMP3、MMP9和基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TissueInhibitorofMetalloproteinase1,TIMP1)的mRNA表達上,姜黃素比維甲酸的作用更強,更系統(tǒng)化。
   第三部分,姜黃素和維甲酸對體外培養(yǎng)的人視網膜色素上皮細胞外基質和粘附分子蛋白質水平的影響
   目的:通過觀察姜黃素和維甲酸對體外和體內人RPE細胞移行能力的影響和細胞外基質基因的表達,應用weste

16、rnblotting測定姜黃素和維甲酸對人RPE細胞外基質和粘附分子中部分相應蛋白質表達的影響,探討姜黃素和維甲酸重塑人RPE細胞外基質的影響因素及作用機制,探討蛋白質與基因的表達是否一致。
   方法:選取第9代生長狀態(tài)良好的人RPE細胞用于本研究。通過westernblotting描述0.5×10-5M的姜黃素和10-5M的維甲酸干預人RPE(1×107)48h后細胞外基質和粘附分子蛋白質的表達。并與不加任何藥物的空白對照組

17、進行比較。
   結果:與對照組比較,0.5×10-5M的姜黃素顯著地抑制纖維粘連蛋白1,MMP1,MMP2和MMP9蛋白質的表達,增強MMP3蛋白質的表達;而10-5M的維甲酸顯著地抑制纖維粘連蛋白1,MMP1,MMP2,MMP9,MMP14,整合素ITGAM和ITGB2,增強了MMP3和鈣粘連蛋白-E蛋白的表達;姜黃素和維甲酸比較,姜黃素對MMP3蛋白質表達的作用較強。
   結論:姜黃素和維甲酸對人RPE細胞外基質

18、和粘附分子的蛋白質表達影響是顯著的,有選擇性的,并有類似的作用機制。這兩種藥物共同抑制MMP1,MMP2,MMP9,纖粘連蛋白1(Fibronectin1)等;共同增強MMP3的表達。姜黃素和維甲酸對人RPE細胞外基質和粘附分子蛋白質的調節(jié)與對基因的調節(jié)是一致的。
   第四部分,姜黃素對體外培養(yǎng)的人視網膜色素上皮細胞內鈣離子的影響
   目的:觀察人視網膜色素上皮細胞內鈣離子的變化,探討不同濃度姜黃素干預后,在人視網膜

19、色素上皮細胞和其基質間可能存在的相關信號轉導作用機制。
   方法:對各組第6代人RPE細胞進行5μMFluo-3負載30min,姜黃素分別以0、0.25×10-5、0.5×10-5、1.0×10-5、2.0×10-5、4.0×10-5M濃度干預人RPE細胞,利用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)測定各組RPE細胞內早期鈣離子的熒光變化。
   結果:LSCM檢測結果:0、0.25×10-5、0.5×10-5、1.0×10

20、-5、2.0×10-5、4.0×10-5M姜黃素組RPE細胞內均有鈣熒光。空白對照組鈣熒光強度明顯低于姜黃素各組,細胞內鈣離子的熒光強度與姜黃素的刺激濃度呈正相關(r=0.922,P<0.05)。
   結論:體外培養(yǎng)的人RPE細胞經不同濃度姜黃素干預后,較空白對照組,早期細胞內鈣離子熒光強度明顯增加。結合四部分的實驗數據,我們推斷當細胞受到姜黃素外界信號刺激時,細胞內鈣離子濃度能迅速增加,繼而傳遞信號,重塑細胞外基質,引起細胞

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