mTOR信號通路在慢性痛形成和維持中的作用及機制.pdf

1、研究背景:哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它存在于哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)。mTOR可形成兩種功能不同的蛋白質(zhì)復合物。當它結合到Raptor蛋白，便形成mTOR的復合物1，它對雷帕霉素敏感，并控制蛋白質(zhì)的翻譯，參與形成持續(xù)性疼痛及其引起的疼痛敏感。
　　慢性痛持續(xù)性疼痛是一個重大的世界性公共衛(wèi)生問題。它的特點是疼痛過敏，包括自發(fā)的持續(xù)或間歇性燒灼樣疼痛，對疼痛刺激通常無害的刺激反應過強。其生物化學機制包

2、括初級傳入神經(jīng)元的背根神經(jīng)節(jié)（DRG）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)接受傷害刺激的突觸上受體、酶和離子電壓依賴通道的表達和功能的變化。mTOR的翻譯和表達，在持續(xù)性疼痛的疼痛敏感機制中具有重要的作用。
　　有文獻報道，生長因子可通過 PI3K、AKT來調(diào)控 mTOR，在大鼠皮膚的有髓感覺纖維亞群上發(fā)現(xiàn)了磷酸化的mTOR和它下游的一些翻譯元件（p-70S6K和p-4E-BP1）。用肌電圖證實應用mTOR抑制劑，可以降低損傷后機械痛敏相關的一些有髓傷

3、害感受的敏感性；行為學結果表明，局部注射mTOR抑制劑雷帕霉素可以顯著降低組織損傷引起的持續(xù)疼痛。同樣，局部應用mTOR抑制劑可以降低損傷點周圍的機械痛敏，降低外周神經(jīng)損傷引起的長時機械痛敏?？梢?，mTOR通過調(diào)節(jié)局部蛋白質(zhì)的合成而完成對外周傳入纖維的傷害性敏感性的調(diào)節(jié)。由于外周感覺傳入神經(jīng)元屬假單極神經(jīng)元，以及軸突雙向轉運的存在，推測在脊髓可能同樣存在mTOR依賴的局部蛋白質(zhì)合成。但對于非疼痛狀態(tài)下mTOR信號通路及其下游因子在脊髓和

4、DRG的表達分布和細胞定位未見有報道。
　　研究發(fā)現(xiàn)，mTOR在神經(jīng)系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)非神經(jīng)細胞的增殖，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育，調(diào)節(jié)突觸的可塑性。在神經(jīng)系統(tǒng)的某些疾病如帕金森病、阿爾茨海默病都常合并有mTOR通路的異常。mTOR被神經(jīng)遞質(zhì)、營養(yǎng)因子、激素、缺血等多種物質(zhì)激活后，通過其下游的效應器調(diào)節(jié)蛋白的翻譯，并通過下游多種途徑對靶蛋白進行磷酸化而發(fā)揮抗凋亡作用。而雷帕霉素是其特異性抑制劑。對于鞘內(nèi)給予雷帕霉素對CCI大鼠痛閾以及對mTOR信

5、號通路的影響未見有報道。
　　近來的研究表明，mTOR和它下游的效應器也許會涉及神經(jīng)性疼痛、炎癥疼痛和癌痛。系統(tǒng)和局部注射雷帕霉素，一種選擇性的mTOR抑制劑，已經(jīng)證明能減緩機械刺激的超敏反應，無論超敏反應是由足底注射卡拉膠或辣椒素（炎癥疼痛）、外周神經(jīng)損傷（神經(jīng)性疼痛）所誘導，還是由注射前列腺癌細胞進脛骨（骨癌疼痛）所誘導。雖然mTOR和S6K1在小的DRG神經(jīng)元和脊髓后角神經(jīng)元高度表達，但是在通常條件下，他們的激活（磷酸化）產(chǎn)

6、物僅是低水平的表達。已有研究表明，足底注射卡拉膠或骨癌引起的損傷會導致大鼠脊髓后角p-mTOR和p-S6K1的增加，但是在DRG沒有。然而，對mTOR在慢性炎癥疼痛的所起的作用卻知之甚少。而且，在脊髓和DRG的外周神經(jīng)損傷后，是否mTOR和它的下游效應器會被激活還存在爭議。
　　神經(jīng)性疼痛慢性疼痛的生物學機制目前尚未完全明了，控制與治療也并不完善。新開發(fā)的以受體靶標作用于周邊C-感受器以降低神經(jīng)性疼痛的藥物已經(jīng)證明作用甚微，靶向于

7、A-傷害性感受器可用于治療慢性疼痛。事實上，A-纖維敏感背角神經(jīng)元的信號放大可能與神經(jīng)病理性疼痛的二次痛覺過敏（損傷部位周圍對傷害性刺激敏感性增加）和異常性疼痛（疼痛由于一個正常無害刺激）的兩個臨床特征有關。調(diào)節(jié) A-疼痛感受器作用于 mTOR信號通路有助于提高外周損傷后疼痛的感覺靈敏度。研究顯示，局部皮膚給予雷帕霉素，阻斷激活的mTOR下游目標，緩解了局部炎癥或神經(jīng)性疼痛相關的機械性超敏反應。因此，作用于 mTOR信號通路可作為傷害感

8、受器靈敏度的調(diào)節(jié)。如果靶向的mTOR信號通路具有潛在的治療作用用于控制神經(jīng)性疼痛慢性疼痛，而全身性用藥的作用則尚不清楚。
　　針對mTOR信號通路在慢性疼痛中發(fā)揮的特殊作用，結合現(xiàn)有的臨床應用的相關藥物產(chǎn)生的抑制或影響通路傳導的作用，在動物模型上獲得減弱或消除慢性疼痛相關癥狀的效果。對mTOR信號通路的進一步深入研究，將有助于研發(fā)效力更強、副作用更小的新型靶向治療慢性疼痛的藥物。
　　本研究觀察非疼痛狀態(tài)下mTOR及其下游因

9、子真核細胞起始因子4E結合蛋白1（4E-BP1）、p70核糖體S6蛋白激酶（p70S6K），以及其磷酸化形態(tài)在脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)（DRG）和的表達和分布，以及細胞定位。觀察經(jīng)不同途徑（鞘內(nèi)給藥、局部給藥、全身性給藥）抑制mTOR信號通路對神經(jīng)性痛、炎性痛等不同疼痛模型誘導慢性痛的形成和維持以及對機械和冷痛熱痛超敏反應的影響，探討mTOR信號通路在慢性痛中的作用及其機制。
　　研究目的:觀察mTOR及其下游因子真核細胞起始因子4E

10、結合蛋白1/2（4E-BP1/2）、p70核糖體S6蛋白激酶（p70S6K），以及其磷酸化形態(tài)在脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)（DRG）和的表達和分布。觀察經(jīng)不同途徑（鞘內(nèi)給藥、局部給藥、全身性給藥）抑制mTOR信號通路對神經(jīng)性痛、炎性痛等不同疼痛模型誘導慢性痛的形成和維持以及對機械和冷熱痛超敏反應的影響，評價mTOR信號通路在慢性痛中的作用及其機制。
　　研究方法:
　　（1）以逆轉錄-聚合酶鏈反應、Western blot確定非疼

11、痛狀態(tài)下mTOR及其下游因子4E-BP1/2和p70S6K及其磷酸化形式在背根神經(jīng)節(jié)和背角的表達。免疫組化染色確定mTOR、4E-BP1和p70S6K及其磷酸化形式在背根神經(jīng)節(jié)和背角的定位，并定量分析。
　　（2）經(jīng)行為學檢測、免疫組化染色、免疫印跡方法分析鞘內(nèi)給予 mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素對CCI術后大鼠機械痛閾和熱痛閾以及脊髓背角膠質(zhì)細胞的影響。
　　（3）經(jīng)行為學檢測、免疫組化染色、免疫印跡方法分析完全弗氏佐劑(

12、complete Freund's adjuvant，CFA)足底注射導致的慢性炎癥疼痛過程中和在脊神經(jīng)結扎(SNL)導致的神經(jīng)性疼痛過程中，mTOR和S6K1在大鼠的DRG和脊髓的表達和激活。
　?。?）經(jīng)行為學檢測、免疫組化染色、免疫印跡方法分析西羅莫司脂化（CCI-779）足底局部和全身性給藥對神經(jīng)病理性疼痛的影響，以及觀察Torin1全身性給藥對神經(jīng)病理性疼痛的影響。
　　結果:
　?。?）mTOR、4E-BP

13、1和p70S6K分布在整個脊髓背角和DRG，特別是在脊髓背角的外層，而磷酸化形式在脊髓背角和DRG表達都非常低，沒有檢測到。在脊髓背角，mTOR、p70S6K和4E-BP1表達于神經(jīng)元細胞，在星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞沒有表達。在DRG，mTOR和p70S6K表達于神經(jīng)元細胞，26.1％（±3.2％）呈mTOR表達陽性，19.1％（±1.9％）呈p70S6K表達陽性；4E-BP1則表達于衛(wèi)星膠質(zhì)細胞。
　　（2）與對照組相比，CCI

14、組機械痛閾和熱痛閾從CCI第4天開始下降；前后給藥對照劑組與CCI組相比無明顯差異。與CCI組相比，前給藥組痛閾從CCI第4天開始上升，直到第14天都有明顯差異。與CCI組相比，后給藥組痛閾從CCI第8天開始上升，直到第14天都有明顯差異。與正常組比較，CCI組、前、后對照劑組損傷側脊髓背角GFAP陽性面積與陽性區(qū)平均光密度均有明增加。與CCI組比較，前、后給藥組損傷側GFAP陽性面積與陽性區(qū)平均光密度均有明顯降低。
　　（3）C

15、FA注射產(chǎn)生機械刺激的超敏反應，縮爪閾PWT減少；熱疼痛的超敏反應，縮爪潛伏期 PWL減少?；紓瘸舴磻贑FA注射后的2h出現(xiàn)，約1天后達高峰值，并且持續(xù)7天。mTOR和S6K1的激活水平隨著時間的推移而顯著增加。和對照組相比，CFA注射后2h，p-mTOR和p-S6K1顯著增加(p-mTOR：2.58±0.52倍于對照組；p-S6K1：2.49±0.03倍于對照組；P<0.05)，并且持續(xù)至少7天。鞘內(nèi)注射雷帕霉素大鼠的同側的PWT

16、增加了5.25倍，相比于空白對照的大鼠，P<0.01；PWL(3.59±0.26 s)顯著減少，相比于基礎的PWL(10.28±0.60s)，P<0.01。鞘內(nèi)注射雷帕霉素大鼠的同側的PWL增加了1.6倍，P<0.05。
　?。?）在皮膚和背根神經(jīng)節(jié)的有髓初級傳入神經(jīng)纖維有磷酸化 mTOR（p-mTOR）表達，mTOR和其磷酸化（P-mTOR）形式與傳入感覺神經(jīng)的標志物PGB共染，并且表達于周圍皮膚組織的非神經(jīng)元細胞，表明其廣泛表

17、達于初級傳入感覺神經(jīng)纖維亞群。P-mTOR連續(xù)表達于軸突，真皮層內(nèi)P-mTOR陽性軸突可達數(shù)百微米。足底注射CCI-779降低神經(jīng)病理性痛模型的機械痛和冷痛閾，全身性給予CCI-779降低神經(jīng)性疼痛和炎癥性疼痛小鼠對機械和冷刺激的反應。
　　結論:
　　（1）在非疼痛狀態(tài)下，mTOR及其下游因子p70S6K和4E-BP1/2在脊髓背角和DRG表達豐富，而它們的磷酸化活化形式表達非常低。
　　（2）鞘內(nèi)給予雷帕霉素抑制m

18、TOR信號通路可以降低神經(jīng)病理性痛模型CCI大鼠的機械痛和熱痛超敏反應，并抑制脊髓背角膠質(zhì)細胞的激活。
　?。?）在大鼠足底注射CFA誘導的外周炎癥激活了mTOR信號通路，mTOR及其下游因子磷酸化在脊髓和DRG的表達增加，鞘內(nèi)注射雷帕霉素可以抑制CFA誘導的疼痛超敏反應。
　　（4）足底注射CCI-779降低神經(jīng)病理性痛模型的機械痛和冷痛閾，全身性給予CCI-779或Torin1可以抑制脊髓和DRG的mTOR信號通路活化，