MAPK信號轉(zhuǎn)導通路在慢性氟中毒大鼠腦損傷發(fā)病機制中的作用.pdf

1、慢性氟中毒可造成機體多系統(tǒng)、多器官和多組織的損害，攝入過量的氟對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害已經(jīng)被廣泛認可和重視，但是慢性氟中毒引起腦損傷的發(fā)生機制尚未完全闡明清楚。神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導通路在慢性氟中毒發(fā)病機制中的研究已引起許多學者的注意，已發(fā)現(xiàn)過量氟在腦組織中蓄積可通過細胞膜受體將刺激信號傳入到細胞內(nèi)，并產(chǎn)生相應的細胞結構和功能的改變。本實驗目的是采用飲水型慢性氟中毒大鼠模型和體外經(jīng)氟處理的培養(yǎng)細胞，研究在氟暴露條件下有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）

2、信號轉(zhuǎn)導通路的改變，探討其在慢性氟中毒性腦損傷發(fā)生機制中的作用。
　　本實驗采用病理學、生物化學和分子生物學方法進行研究。通過檢測氟斑牙發(fā)生、尿氟、血氟和骨氟含量，結合動物一般情況觀察慢性氟中毒動物的中毒表現(xiàn)，判斷動物模型復制情況；通過行為學實驗檢測慢性氟中毒對大鼠學習記憶能力影響；用形態(tài)學檢查方法觀察慢性氟中毒大鼠腦組織神經(jīng)病理學改變；用免疫組織化學方法檢測 MAPK信號通路主要激酶，即細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）、c

3、-Jun氮末端激酶（JNK）和p38MAPK，上游激酶 Ras及下游轉(zhuǎn)錄因子環(huán)一磷酸腺苷反應單元結合蛋白（CREB）在腦組織的表達定位；用Western-blotting和Real-time PCR方法檢測大鼠腦組織和體外培養(yǎng)細胞中MAPK信號通路激酶蛋白和mRNA表達水平；測定用RNA干擾技術使神經(jīng)型尼古丁受體α3亞單位mRNA沉默的細胞中 MAPK信號轉(zhuǎn)導通路中激酶改變；用流式細胞技術檢測大鼠腦組織和體外培養(yǎng)細胞凋亡率。
　　

4、本實驗研究結果顯示，慢性氟中毒大鼠發(fā)生不同程度的氟斑牙，體重降低，其尿氟、血氟、骨氟含量明顯高于對照組，這些表現(xiàn)表明本實驗成功地復制了慢性氟中毒大鼠模型。
　　研究結果發(fā)現(xiàn)，慢性氟中毒大鼠學習記憶能力下降，腦組織神經(jīng)元出現(xiàn)細胞質(zhì)濃縮、嗜酸性增強、尼氏小體減少。Ras、phospho-ERK1/2、及phospho-JNK激酶在大鼠腦組織大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)毯中有陽性表達；phospho-p38激酶、轉(zhuǎn)錄因子 CREB在大鼠腦組織海馬

5、及皮質(zhì)神經(jīng)元胞質(zhì)中有陽性表達。對激酶蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)，慢性氟中毒大鼠腦組織中Ras、phospho-ERK1/2、phospho-JNK、phospho-CREB及 total-ERK1/2表達均增高，phospho-p38、total-p38、total-JNK及 total-CREB表達無明顯變化。對各激酶轉(zhuǎn)錄水平表達檢測發(fā)現(xiàn)，染氟三個月檢測時發(fā)現(xiàn)，各激酶 mRNA表達較對照組降低；染氟六個月后檢測發(fā)現(xiàn)，Ras和JNK激酶mRNA表

6、達較對照組降低而ERK1/2、p38和CREB激酶表達較對照組升高。檢測大鼠腦組織細胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，染氟三個月時大鼠腦組織凋亡率在各組無差異，染氟六個月時染氟組較對照組凋亡率升高。體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞經(jīng)氟處理后，凋亡率升高；用低劑量氟處理時c-jun基因mRNA表達升高，用高劑量氟處理時降低；c-fos基因 mRNA表達升高；經(jīng)氟處理細胞中phospho-ERK1/2激酶表達升高；應用ERK1/2通路抑制劑在氟暴露前后對c-fos

7、基因mRNA表達及細胞凋亡率無明顯影響；經(jīng)氟處理的細胞中phospho-JNK激酶表達升高，而應用JNK通路抑制劑可抑制氟引起的細胞凋亡，也可影響c-jun基因mRNA表達；經(jīng)氟處理的細胞中phospho-p38激酶表達升高；應用p38激酶通路抑制劑抑制其活性后再用氟處理細胞發(fā)現(xiàn)，細胞中c-fos基因mRNA表達和細胞凋亡率均較未使用抑制劑時降低。對通路間相互作用的研究結果發(fā)現(xiàn)，JNK通路和p38通路分別與ERK1/2通路相互作用，結果

8、促進ERK1/2激酶活化；p38通路與ERK1/2通路相互作用促進c-fos表達和細胞凋亡率升高；JNK通路和ERK1/2通路相互作用對c-fos表達無明顯影響。用氟處理后，具有神經(jīng)型尼古丁受體α3亞單位mRNA沉默的SH-SY5Y細胞中phospho-ERK1/2激酶表達升高，其升高程度較沒有該受體mRNA沉默的SH-SY5Y細胞更加明顯；氟處理低表達神經(jīng)型尼古丁受體α3亞單位的SH-SY5Y細胞中phospho-JNK激酶表達升高，

9、但較同時間點氟處理SH-SY5Y細胞中phospho-JNK激酶的表達偏低；在兩種細胞中對p38激酶表達檢測也發(fā)現(xiàn)類似的結果。
　　研究結果表明，（1）慢性氟中毒可導致MAPK信號通路激活，其中ERK1/2通路較早地受到氟的影響；ERK1/2信號通路在氟作用下的激活可能與維持神經(jīng)細胞正常功能有關。（2）JNK信號通路激活可能是氟作用下導致細胞凋亡的環(huán)節(jié)之一。（3）ERK1/2信號通路和JNK信號通路在蛋白表達水平存在正性相互作用，

10、但該兩個信號通路在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控c-fos的表達上無相互作用；ERK1/2信號通路與p38信號通路之間在蛋白表達水平和對c-fos基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控及細胞凋亡作用三方面都起正性作用，即二者作用相互促進。（4）氟存在條件下，ERK1/2通路激活可能不依賴神經(jīng)型尼古丁受體α3亞單位，該受體亞單位可能對保護JNK通路引起的細胞凋亡具有一定作用；而p38通路亦可能對神經(jīng)型尼古丁受體α3亞單位的表達有依賴性。
　　綜上所述，在慢性氟中毒導致的