人PDLIM4基因在前列腺癌的表達調(diào)控研究.pdf

1、前列腺癌(prostate cancer,PCa)是歐美國家常見的腫瘤,居男性腫瘤死亡原因第二位,僅次于肺癌。我國前列腺癌的發(fā)病率雖低于西方國家,但隨著生活水平的提高及人口老齡化發(fā)展,其發(fā)病率正迅速上升,成為危害中老年男性健康的主要疾病。前列腺癌的發(fā)病及惡化轉(zhuǎn)移機制復雜,不僅與種族,飲食、生活習慣等關(guān)系密切,并且癌基因和抑癌基因及其相應(yīng)的信號通路的異常調(diào)控直接參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展[1,2]。
　　 Vanaja等[3]根據(jù)

2、芯片結(jié)果分析PDLIM4(PDZ and LIM domain4)基因在前列腺癌中表達發(fā)生沉默。PDLIM4基因,又稱RJL(reversion-induced LIM gene),是定位于5號染色體長臂上31.1的抑癌基因,編碼含PDZ和LIM區(qū)域的蛋白,生物學功能目前尚未清楚[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)PDLIM4基因在正常細胞中普遍表達,而在腫瘤細胞中常發(fā)生缺失,通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染恢復表達可以抑制腫瘤細胞增殖和集落形成,并促進細胞發(fā)生凋亡[6]

3、。初步認為具有抑癌基因的功能。目前研究表明,PDLIM4低表達與雜合子缺失、啟動子區(qū)域CpG島的異常高甲基化密切相關(guān),且PDLIM4甲基化失活常和前列腺癌預后較差相關(guān)[6,7]。
　　 DNA甲基化是表觀遺傳學主要研究內(nèi)容之一。DNA甲基化主要指基因啟動子區(qū)域CpG島中胞嘧啶C發(fā)生甲基化,由于DNA甲基化是一個可逆的過程,通過藥物逆轉(zhuǎn)啟動子區(qū)域的甲基化可使沉默的基因恢復表達[8-11]。DNA甲基化可導致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活,進而影

4、響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-15]。人前列腺癌中PDLIM4基因啟動子核心區(qū)域中含有多個CpG島,已證實其CpG島高度甲基化與PDLIM4表達下調(diào)密切相關(guān)但其調(diào)控機制尚不明確。
　　 我們首先通過免疫組化檢測中國漢族人群中前列腺癌患者PDLIM4在前列腺增生組織及前列腺癌組織中的表達,已確定該基因的表達是否存在種族差異。同時檢測相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)DNMT3A及DNMT3B在相應(yīng)

5、組織中的表達水平。結(jié)果顯示在前列腺癌組織中PDLIM4的表達明顯低于正常癌旁組織及前列腺增生組織,與國外的研究報道一致,表明該基因的表達無顯著的種族差異。而DNMT3A及DNMT3B表達在增生組織及癌組織中無明顯差異。
　　 為了研究PDLIM4基因在前列腺癌中低表達的調(diào)控機制,我們通過Westernblotting確定前列腺癌激素依賴及非依賴細胞株中PDLIM4蛋白的表達水平。結(jié)果顯示,PDLIM4在正常人前列腺永生細胞株RW

6、PE1中表達,而在激素非依賴的前列腺癌細胞PC-3、激素依賴的LNCaP中表達沉默。經(jīng)過甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dc處理后,LNCaP細胞中PDLIM4的表達明顯上調(diào),而RWPE1和PC3表達未發(fā)生明顯改變,表明PDLIM4的表達不僅與其啟動子CpG島甲基化有關(guān),可能還存在其它的調(diào)控機制。
　　 由于PDLIM4的表達調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,我們以基因組DNA為模板,通過PCR擴增獲得PDLIM4基因啟動子序列片段,插入到pGL

7、3-Basic報告基因載體,分別得到含有3kb和1.2kb的PDLIM4基因啟動子的兩個報告基因質(zhì)粒pGL3-PDLIM4-3kb和pGL3-PDLIM4-1.2kb。另外,pGL3-PDLIM4-1.2kb質(zhì)粒運用外切酶Ⅲ將啟動子從5’端截短獲得系列不同短片段的啟動子序列,并構(gòu)建其熒光素酶報告基因的重組質(zhì)粒,得到5個含不同長度啟動子序列的報告基因載體:pGL3-PDLIM4—970bp,pGL3一PDLIM4-803bp,pGL3-P

8、DLIM4-653bp,pGL3-PDLIM4-645bp,pGL3-PDLIM4—627bp。利用PDLIM4啟動子及其不同截短體報告基因轉(zhuǎn)染不同組織來源細胞系及各前列腺細胞株,檢測其表達情況。結(jié)果表明,PDLIM4基因長片段的3kb和1.2kb啟動子熒光素酶質(zhì)粒,在乳腺癌細胞株、宮頸癌細胞株、人口腔上皮腫瘤細胞株、前列腺癌細胞株中均有不同程度的表達活性,,其中在前列腺癌細胞株P(guān)C3、LNCaP中表達較低。而不同長度的PDLIM4啟動

9、子報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3、LNCaP的結(jié)果顯示,pGL3-PDLIM4-1.2kb表達活性最強,pGL3-PDLIM4-970bp表達活性最弱,說明在啟動子-1275bp至-970bp區(qū)域內(nèi)可能存在一個正調(diào)控元件。
　　 前列腺癌細胞株轉(zhuǎn)染PDLIM4啟動子,經(jīng)5-aza—dc處理后,與未處理的細胞比較啟動子活性變化。結(jié)果顯示,LNCaP經(jīng)5-aza-dc處理后PDLIM4的啟動子活性明顯上調(diào)(p<0.05),而PC-3經(jīng)5-

10、aza—dc處理后啟動子活性發(fā)生下調(diào),RWPE1未發(fā)生明顯改變。經(jīng)5-aza—dc處理后啟動子活性的變化與蛋白表達水平的變化相一致。說明了甲基化在激素依賴的LNCaP是主要的調(diào)控機制,而在激素非依賴的PC-3細胞中可能存在非甲基化調(diào)控機制。
　　 綜上所述,抑癌基因PDLIM4在中國漢族人群前列腺癌組織和激素依賴的前列腺癌細胞中沉默,其啟動子區(qū)域的甲基化對基因的沉默起著重要作用,去甲基化后可使PDLIM4在轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平上恢