m3受體對撤血清誘導的CHO細胞凋亡的保護作用及信號轉導.pdf

1、該次試驗將攜帶毒蕈堿受體m3亞型的基因轉染到CHO-K1細胞中,建立穩(wěn)定表達的含有單一毒蕈堿受體m3受體亞型的細胞系,并采用撤血清誘導CHO細胞凋亡模型.研究激動m3受體對凋亡的細胞作用并探討與此相關的信號轉導通路,采用m3單克隆抗體探討不同條件下CHO細胞中m3受體表達情況.方法:1、采用脂質體包裹的方法將攜帶有毒蕈堿受體m3亞型基因的PCDNA的質粒經(jīng)擴增純化后,轉染至CHO-K1細胞內,建立穩(wěn)定表達單一毒蕈堿受體m3受體亞型的細胞

2、系.2、采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western-blotting檢測CHO細胞表面毒蕈堿受體m3受體亞型的表達.3、應用撤血清的方法誘導含有毒蕈堿受體m3受體亞型的CHO細胞凋亡,凋亡指標包括MTT觀察細胞存活率、Hoechst33258觀察細胞核、FDA觀察細胞形態(tài)的改變,DNAladder分析DNA降解.4、觀察毒蕈堿受

3、體激動藥氨甲酰膽堿及其阻斷劑阿托品對細胞凋亡的影響.5、RT-PCR檢測m3受體轉錄水平在撤血清誘導的CHO-m3細胞凋亡過程中的動態(tài)變化.6、Western blottingting檢測在撤血清誘導的CHO-m3細胞凋亡過程中m3受體表達的動態(tài)變化.7、Western blottingting研究細胞內c-jun、ERK1/2的磷酸化水平的改變.結論:1、將攜帶有毒蕈堿受體m3受體亞型的cDNA的質粒成功轉染至CHO細胞,獲得穩(wěn)定的表