空腸彎曲菌感染人和雞體內表達抗原的篩選及其生物學特性初步鑒定.pdf

1、ScreeningofinvivoinfectionrelatedantigensfromCampylobacterjejuni。humanandchickenhqcampylobacterlelUnlinUmanandChickenhostsand—analysisofbiologycharactersByYuanqingHuAdvisor：ProfJianpinTaoProfXinanJiaoADissertationSubmitt

2、edtoYangzhouUniversityInPartialFufillmentoftheRequirementfortheDoctorDegreeinPreventiveVeterinaryMedicineCompletedinNovember2012CommencementinDecember20122揚州大學博士學位論文首先選擇與細菌黏附、定植、入侵、外毒素和脂多糖合成等相關的27個毒力基因為檢測靶基因，然后參考已公布的空腸彎曲

3、菌NCTC11168標準株全基因組序列，分別設計特異性PCR引物，最后分別對人源株和雞源株進行PCR檢測。結果顯示：雞源空腸彎曲菌分離株中，黏附相關基因peblA和cadF的陽性率較高，分別為100％和97％；定植因子中陽性率最高的是eheY，雞分離株為100％，人分離株為92％；入侵相關基因中，雞源株的分布陽性率均小于90％，最小的為virBll(97％)；人源株的陽性率最高為92％(iamA)，最低的virBll僅為5％；外毒素相關

4、基因cdtA、cdtB和cdtC在人源株與雞源株間并無明顯差異，均以cdtB為最高，分別是97％和94％；脂多糖合成相關基因wlaN、waaF、neuBll檢出率在人源和雞源空腸彎曲菌的分離株中均不高。人源和雞源空腸彎曲菌分離株中毒力基因的分布總體沒有明顯差異，但不同功能基因略有不同，人源株中入侵和脂多糖合成相關的基因分布較高。本部分對空腸彎曲菌已知毒力基因在人和雞源分離株中的分布分析，有助于為體內毒力基因的篩選提供參考。2空腸彎曲菌全

5、基因組表達文庫的構建及鑒定空腸彎曲菌是一種重要的人獸共患病原菌，雞是其主要的貯存宿主，人感染后多表現(xiàn)為自限性胃腸炎。本研究旨在構建空腸彎曲菌NCTC11168株的基因組表達文庫，為研究空腸彎曲菌體內表達抗原及其致病機制奠定基礎。首先將該菌的基因組DNA用Sau3AI部分酶切后，切膠回收大d400“3000bp的片段。然后用BamHI酶切原核表達pET30a(b，c)系列載體，用SAP去磷酸化后，切膠回收線性質粒載體。接著將回收的基因組D

6、NA片段與線性載體按10：1摩爾比例連接，轉化DH5a感受態(tài)細胞，用載體特異性引物分析插入片段大小分布和插入正確率。然后從轉化的平板上刮菌提取重組質粒，轉化表達宿主菌BL21(DE31的感受態(tài)細胞，獲得該菌的原核表達文庫。用IPTG誘導轉入文庫質粒的BL21(DE3)大腸桿菌，SDSPAGE鑒定被誘導蛋白的表達情況。最后確定該菌基因組表達文庫構建的關鍵參數(shù)：用常規(guī)方法提取基因組，以05U／ggSau3AI在37℃部分酶切基因組30min

7、，片段集中于400“3000bp。載體用25U／pgBamHI線性化，后用08U／／tgSAP將其完全去磷酸化。按基因組片段與載體摩爾數(shù)10：1連接轉化DH5a感受態(tài)細胞，獲得了基因組表達文庫。結果顯示：庫容量達52700個克隆，其可以覆蓋空腸彎曲菌NCTC11168株的全基因組4次以上，片段插入正確率為833％917％，片段大小介于400一3000bp，且均勻分布，IPTG誘導體外表達文庫后蛋白呈現(xiàn)正確表達。本研究成功構建了空腸彎曲菌