人重組IL-17蛋白的表達及其生物學特性的初步分析.pdf

1、Th1-Th2的經典分類的提出已經有20年了，它為我們深入理解固有免疫和適應性免疫之間的相互聯系提供了新的思路和研究模型。然而隨著IL-17和IL-12兩個家族的細胞因子的發(fā)現和研究，這種分類方法逐漸被予以改變：認為機體內存在以分泌IL-17為特征的T細胞亞群，和以往的Th1，Th2都不同，這群細胞在IL-23，IL-6和IL-1誘導后產生IL-17細胞因子，并發(fā)揮獨特的生物學效應，從而解釋了以前在免疫調節(jié)，宿主抵抗病菌，免疫病理等方面

2、未能解釋的問題。這種T細胞現在命名為Th17細胞。它的特異性在于能分泌IL-17細胞因子，參與體內多種免疫反應。Th17細胞數量和IL-17在機體內表達水平的改變，以及Th17細胞和Th1細胞比例的變化與疾病的發(fā)展密切相關并成為廣為關注的研究課題。為此，本研究旨在表達重組蛋白和生物學特性分析作為切入點，為本單位開展相關工作奠定了一定的物質基礎。 一．人IL-17基因全長及去信號肽片段的克隆和載體的構建 根據文獻報道的人I

3、L-17的基因序列設計合成了全長和去信號肽的特異性引物。采用RT-PCR方法從人外周血PHA刺激活化的T細胞中擴增了人IL-17全長基因和去信號肽基因。應用雙酶切法酶切載體和目的基因，再用連接酶連接酶切回收后的產物。測序正確后，在TOP10宿主菌中增殖PQE3.0/IL-17和PCEP4/IL-17質粒，經酶切和PeR鑒定后PQE3.0/IL-17轉化M15表達菌株。 二．人PQE3.0/IL-17融合蛋白在大腸桿菌中的表達和鑒

4、定 在LB細菌培養(yǎng)基中增殖M15表達菌，采取一系列實驗條件，包括降低溫度，縮短誘導時間等，均證實不能誘導可溶性IL-17融合蛋白的表達，而表達的蛋白主要集中在包涵體內。表達動力學分析表明，應用1 mmol/L．IPTG誘導5 h可獲得最有效的表達。實驗室規(guī)模增殖表達菌，經超聲裂解和離心，沉淀變性及復性，透析后經HiTrap親和層析柱一步純化融合蛋白。實驗結果表明，純化后的IL-17/His融合蛋白純度可達90％以上，定量為2 m

5、g／ml。應用Western-blot對融合蛋白進行生物學鑒定，結果為約15KD的單一條帶。 三．人IL-17在真核系統中的表達 抽取PCEP4/IL-17質粒，轉染CHO細胞，應用潮霉素進行篩選，在顯微鏡下觀察到陽性克隆，胰蛋白酶消化細胞，再用移液尖挑取陽性克隆分孔培養(yǎng)，繼續(xù)使用藥物篩選，直到所獲得的克隆表達穩(wěn)定為止。吸取陽性克隆細胞培養(yǎng)的上清，用ELISA方法定性和定量檢測IL-17的表達情況。實驗的結果是所獲得表達

6、量較高的融合蛋白。 四．人IL-17重組蛋白的生物學功能的初步研究 采用人的宮頸癌細胞株HeLa作為反應細胞，按不同濃度加入IL-17/His融合蛋白和IL-17/Fc融合蛋白，反應48小時后，用EIXSA法檢測上清IL-6和GM-CSF的水平，與對照組作比較，觀察兩種IL-17蛋白對HeLa細胞的作用在一定劑量范圍內是否存在劑量依賴關系以及兩種蛋白活性度的高低。 綜上所述，本項研究我們成功地應用原核和真核系統表