XBP1 mRNA參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展機制研究.pdf

1、目的:
　　 緩和內質網應激相關的非折疊蛋白反應(unfoldedproteinresponse，UPR)對于真核生物細胞的存活是至關重要的。作為UPR一個主要的下游通路，X盒結合蛋白1(X-boxbindingprotein1，XBP1)可以觸發(fā)一系列級聯(lián)反應來緩解內質網應激，而它的表達是受一種非常規(guī)的剪接機制所調控的，即在特異性核酸內切酶IRE-1和一種未知的RNA連接酶共同作用下移除XBP1umRNA分子內一個26nt（n

2、ucleotide）的內含子。與已知的發(fā)生于細胞核中的常規(guī)剪接不同，對于這種非常規(guī)剪接的亞細胞定位仍存在很大爭議。而且已知XBP1s與人類腫瘤的發(fā)生密切相關，如肝癌、多發(fā)性骨髓瘤及乳腺癌等，那么腫瘤細胞中XBP1mRNA的剪接及XBP1s轉錄因子的生成是否存在獨立于內質網應激的其他通路也是未知。
　　 本課題擬以乳腺癌細胞系為模型，研究乳腺癌細胞中的XBP1mRNA剪接的亞細胞定位，同時明確乳腺癌細胞中是否存在獨立于內質網應激的

3、XBP1mRNA的非常規(guī)剪接機制及這一非常規(guī)剪接與乳腺癌細胞發(fā)生發(fā)展的關系。以期為乳腺癌的治療提供新的靶點。
　　 方法:
　　 1.通過RT-PCR技術檢測乳腺癌細胞中XBP1mRNA的表達水平及其剪接情況。
　　 2.構建內質網應激熒光蛋白指示器模型ERAI(ERstressactivatedindicator,ERAI)，轉導入MCF-7細胞篩選出理想的細胞模型MCF-7/ERAIm454-557用于研究乳

4、腺癌細胞中XBP1mRNA的非常規(guī)剪接。
　　 3.通過DTT誘導試驗及洗滌試驗評估ERAIm454-557mRNA及XBP1mRNA對內質網應激的敏感性差異。
　　 4.通過RT-PCR評價IRE1α降表達對XBP1mRNA及ERAIm454-557mRNA非常規(guī)剪接的影響。通過免疫熒光試驗檢測在內質網應激條件下乳腺癌細胞中IRE1α的定位。
　　 5.通過核質分離RT-PCR比較細胞質及細胞核中XBP1mRN

5、A及ERAIm454-557mRNA的剪接差異，明確mRNA剪接的亞細胞定位。
　　 6.利用放線菌素D(ActD)抑制MCF-7/ERAIm454-557模型細胞的轉錄后，再行核質分離RT-PCR評價ActD對XBP1mRNA及ERAIm454-557mRNA的剪接影響;另外以20mMDTT誘導MCF-7細胞并隨時間梯度收集總RNA行RT-PCR檢測XBP1mRNA的剪接情況。從而分析內質網應激與非內質網應激依賴性XBP1mR

6、NA剪接的相關性。
　　 7.構建XBP1u與mCHerry熒光蛋白融合的片段缺失亞型，轉導入MCF-7細胞，觀察細胞熒光強度及熒光定位，并通過RT-PCR觀察不同亞型之間XBP1mRNA的剪接差異。
　　 8.構建僅含有XBP1mRNA中莖環(huán)結構的ERAIm485-530模型，并轉導入MCF-7細胞中觀察細胞熒光強度，評價應激敏感序列對XBP1mRNA非常規(guī)剪接的影響。
　　 9.DTT誘導MCF-7細胞后提取

7、細胞質總RNA，平均分為四份分別靜置0min、10min、20min、40min，然后通過RT-PCR檢測XBP1umRNA及XBP1smRNA的水平，評估兩者穩(wěn)定性差異。
　　 10.將XBP1過表達及降表達質粒分別轉導入MCF-7/ERAI454-557模型細胞，RT-PCR實驗檢測XBP1及ERAImRNA表達量的變化及其剪接差異。
　　 11.采用細胞計數(shù)法及SoftAga實驗分別檢測XBP1s降表達及過表達對乳

8、腺癌細胞增殖能力、克隆形成能力的影響。
　　 結果:
　　 1.在無內質網應激的條件下，乳腺癌細胞中存在XBP1smRNA，且水平高于正常乳腺上皮細胞。
　　 2.篩選出了理想的內質網應激指示器模型ERAIm454-557，并經測序證實ERAIm454-557mRNA的剪接與XBP1mRNA的剪接方式相統(tǒng)一。
　　 3.DTT誘導試驗及洗滌試驗證實ERAIm454-557mRNA對內質網應激的敏感性遠遠低

9、于內源性的XBP1mRNA。
　　 4.RT-PCR結果顯示IRE1α降表達質?？梢悦黠@的抑制ERAIm454-557mRNA的剪接;IRE1α免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)DTT誘導組非常明顯的出現(xiàn)IRE1α的細胞核定位，這表明在內質網應激條件下，IRE1α可以易位到細胞核。
　　 5.核質分離RT-PCR結果顯示:在沒有內質網應激的前提下，且細胞核中剪接后的ERAIm454-557mRNA的相對水平與細胞質中的無明顯差異。在內質網

10、應激的條件下，細胞質中剪接后的ERAIm454-557mRNA及XBP1mRNA均明顯增加，而細胞核中并無明顯增加。
　　 6.ActD抑制試驗結果表明在正常條件下，ActD并不能誘導明顯XBP1mRNA的剪接，但是它可以增加細胞核中剪接后的ERAIm454-557mRNA的比率。但是在0.5mMDTT誘導條件下，ActD可以明顯增加XBP1smRNA及剪接后的ERAIm454-557mRNA的比率。在高濃度DTT誘導的內質網應

11、激前提下，隨著誘導時間的延長，細胞質中剪接后的XBP1mRNA明顯增加，而細胞核中剪接后的XBP1mRNA則只是在逐步緩慢的增加。這一結果表明內質網應激也可以促進細胞核中XBP1mRNA的非常規(guī)剪接。
　　 7.5'端缺失的XBP1mRNA亞型可以明顯的增加非內質網應激依賴性的XBP1mRNA的剪接，由此推論XBP1mRNA的結構變化可能會影響非常規(guī)剪接的定位。
　　 8.MCF-7/ERAIm485-530細胞可檢測到

12、微弱的細胞熒光，RT-PCR結果也顯示在無內質網應激條件下ERAIm485-530mRNA存在少許的剪接，且DTT誘導對ERAIm485-530mRNA的剪接并無影響;MCF-7/ERAIm485-530細胞核質分離RT-PCR結果則顯示ERAIm485-530mRNA的非常規(guī)剪接發(fā)生于細胞核中。
　　 9.細胞質總RNA按時間梯度靜置后行RT-PCR結果顯示，隨時間延長XBP1smRNA出現(xiàn)明顯降解，而XBP1umRNA降解不

13、明顯，說明XBP1umRNA的穩(wěn)定性優(yōu)于XBP1smRNA。
　　 10.無內質網應激條件下，XBP1降表達并不能明顯的降低XBP1mRNA的水平;而在DTT誘導下，XBP1降表達不僅明顯降低了XBP1smRNA的水平，還增加了XBP1umRNA的水平。同時，在無內質網應激條件下，XBP1降表達明顯降低了剪接后的ERAIm454-557的水平;而在DTT誘導下，XBP1降表達也可以明顯抑制ERAIm454-557剪接。
　

14、　 11.細胞計數(shù)及SoftAga試驗結果發(fā)現(xiàn)XBP1s過表達后MCF-7細胞增殖能力及克隆形成能力均增強。
　　 結論:
　　 1.乳腺癌細胞中存在非內質網應激依賴性的XBP1mRNA的剪接，且XBP1mRNA莖環(huán)結構兩端的應激敏感序列是XBP1mRNA非常規(guī)剪接的關鍵。
　　 2.非內質網應激依賴的XBP1mRNA的剪接發(fā)生于細胞核中并需要IRE1α的參與。
　　 3.MCF-7細胞中XBP1s的存