Ezrin在乳腺癌發(fā)生發(fā)展及浸潤轉移過程中的作用研究.pdf

1、乳腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。本研究分析了Ezrin在乳腺癌組織中的表達及其意義，并借助反義RNA技術和化療藥物的作用從不同方面研究了抑制Ezrin表達對高侵襲性人乳腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響及可能的作用機制，同時本研究還初步探討了RhoA作為上游調控信號對Ezrin表達的影響，以期明確Ezrin在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉移過程中的作用，為以Ezrin為靶點的乳腺癌靶向治療提供理論依據(jù)。 本研究論文共分為四個部分：

2、 1.Ezrin與乳腺浸潤性導管癌發(fā)生發(fā)展及預后的關系研究 目的：探討Ezrin蛋白在乳腺浸潤性導管癌及導管內增生性病變中的表達及其臨床病理意義。 方法: 采用免疫組織化學方法，檢測臨床病理及隨訪資料完整的88例乳腺浸潤性導管癌及54例導管內增生性病變組織中Ezrin的表達情況，分析其與CD44v6、E-Cadherin表達的關系及其臨床病理意義，采用Kaplan-Meier法及COX模型分析Ezrin表達與乳腺浸潤性

3、導管癌患者預后的關系。 結果: 1.1Ezrin在不同乳腺導管病變中的表達情況: Ezrin在乳腺不典型導管增生和浸潤性導管癌組織中的強陽性表達率明顯高于乳腺普通型導管增生和正常導管上皮組織(P<0.05)，而在浸潤性導管癌組織中的強陽性表達率亦明顯高于不典型導管增生組織(P<0.05)?？梢婋S著乳腺正常導管上皮從普通型導管增生向不典型導管增生、浸潤性導管癌發(fā)展，Ezrin的強陽性表達率逐漸上升。 1.2乳腺浸潤

4、性導管癌Ezrin表達與臨床、病理特征的關系: 乳腺浸潤性導管癌Ezrin表達與腋窩淋巴結轉移密切相關，伴有腋窩淋巴結轉移病例Ezrin強陽性表達率明顯高于不伴有淋巴結轉移者(P<0.05)。Ezrin表達與乳腺浸潤性導管癌組織學分級和臨床分期密切相關，Ezfin強陽性表達率隨分化程度的降低和臨床分期的增高而明顯增高(P均<0.05)。 1.3乳腺浸潤性導管癌Ezrin表達的預后意義: Ezrin強陽性表達組患者在隨訪期內各時點

5、的生存率均明顯低于陰性表達組(P<0.05)。COX模型多因素分析顯示，Ezrin強陽性表達及淋巴結狀況、TNM分期均與預后有相關性(P<0.05)，可以作為判斷乳腺浸潤性導管癌患者預后的獨立指標。 1.4乳腺浸潤性導管癌E-Cadherin、CD44v6表達與Ezrin表達的關系: 經Spearman等級相關檢驗，Ezrin表達與E-Cadherin表達呈負相關性，與CD44v6表達呈正相關性(P均<0.05)。 2.

6、反義RNA抑制Ezrin表達對乳腺癌細胞侵襲能力的影響 目的：特異性阻斷Ezrin的表達，觀察其對人乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖和侵襲能力的影響，以期明確Ezrin在乳腺癌細胞浸潤轉移過程中的作用。 方法: 將anti-pCR3.1-ezrin質粒經脂質體介導，轉染入高轉移性人乳腺癌細胞MDA-MB-231。應用Western-blot和RT-PCR方法檢測Ezrin在MDA-MB-231細胞中的表達；MTT法檢

7、測抑制Ezrin對MDA-MB-231細胞體外增殖能力的影響；Boyden小室法檢測抑制Ezrin對MDA-MB-231細胞體外侵襲能力的影響。 結果: 2.1反義RNA對Ezrin蛋白表達的影響: 轉染anti-pCR3.1-ezrin后，MDA-MB-231細胞中的Ezrin蛋白在24h后明顯降低(P＜0.05)，轉染anti-pCR3.1-ezrin組的Ezrin蛋白表達為轉染pCR3.1空質粒組的24.24％，為

8、對照組的22.22％。 2.2反義RNA對Ezrin mRNA表達的影響: 轉染anti-pCR3.1-ezrin后，MDA-MB-231細胞中的Ezrin mRNA在24h后明顯降低(P＜0.05)；轉染空質粒組的Ezrin mRNA無明顯變化。 2.3反義RNA對MDA-MB-231細胞增殖的影響: MTT法比色實驗結果顯示，轉染anti-pCR3.1-ezrin組、轉染空質粒組和對照組的OD值分別為0.41±0.0

9、18、0.765±0.058和0.795±0.061。轉染anti-pCR3.1-ezrin組細胞的增殖受到明顯抑制，抑制率達47.92％(P＜0.05)。 2.4反義RNA對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響: Boyden小室法檢測結果顯示，轉染anti-pCR3.1-ezrin組細胞的侵襲能力為對照組的50.5％±3.2％(P＜0.95)，轉染空質粒組的細胞侵襲能力與對照組相比無明顯變化。 3.RhoA信號轉導

10、通路參與調節(jié)Ezrin表達的作用研究 目的：探討RhoA信號轉導通路參與調節(jié)Ezrin表達的可能作用。 方法: 給予表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)作用不同時間后，應用Western-blot方法檢測MDA-MB-231細胞內RhoA、RhoA磷酸化形式及Ezrin蛋白的變化情況。給予RhoA激酶特異性抑制劑fasudil預處理后，應用Western-blot方法在RhoA磷酸化和E

11、zrin蛋白的表達高峰時間檢測二者的表達情況。 結果: 3.1 EGF對RhoA的磷酸化和蛋白表達的影響: Western-blot結果顯示，給予EGF刺激后，P-RhoA水平逐漸升高，于30 min時達高峰；RhoA蛋白的表達無明顯變化。 3.2 EGF對Ezrin蛋白表達的影響: Western-blot結果顯示，給予EGF刺激后，Ezrin蛋白水平逐漸升高，于24h時達高峰。 3.3 Fasudil

12、對EGF誘導的RhoA磷酸化及Ezfin蛋白表達的影響: Westem-blot結果顯示，用fasudil預處理MDA-MB-231細胞后，EGF誘導的RhoA磷酸化水平受到明顯抑制，抑制率為72.73％，同時Ezrin蛋白的表達水平亦受到明顯抑制，抑制率為51.28％。 4 小劑量表阿霉素對乳腺癌細胞Ezrin表達和遷移的抑制作用及相關機制研究 目的：探討小劑量法瑪新(進口表阿霉素epirubicin，EPI)抑制乳腺

13、癌細胞遷移的作用機制。 方法: 觀察小劑量表阿霉素對人乳腺癌細胞MDA-MB-231 Ezrin表達和細胞遷移的影響，及Ezrin與E-Cadherin、CD44表達的關系。不同劑量的EPI作用于MDA-MB-231細胞4h后，Western-blot、免疫細胞化學和RT-PCR方法檢測Ezrin、E-Cadherin和CD44表達的變化。傷口愈合實驗檢測細胞遷移能力的變化。MTT法檢測小劑量表阿霉素對細胞活力的影響。

14、結果: 4.1 EPI對Ezrin、E-Cadherin、CD44蛋白表達的影響: Western-blot結果顯示，在不同濃度EPI作用下，Ezrin和CD44的蛋白表達呈逐漸降低趨勢。2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml作用組中，兩種蛋白的表達均明顯低于對照組(P<0.05)。E-Cadherin的蛋白表達在不同濃度EPI作用下，呈逐漸升高趨勢。2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml作用組中，E-Cadhe

15、rin的蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05)。免疫細胞化學檢測得出了相同結果。 4.2 EPI對Ezrin、E-Cadherin、CD44 mRNA表達的影響: RT-PCR檢測結果顯示，各處理組MDA-MB-231細胞中Ezrin mRNA的表達與對照組相比顯著降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)；EPI同樣以劑量依賴性方式抑制CD44 mRNA的表達，而以劑量依賴性方式促進E-Cadherin mRNA的表達。 4

16、.3 EPI對MDA-MB-231細胞遷移的影響: 傷口愈合實驗顯示，隨著EPI濃度的增加，遷移的細胞數(shù)逐漸下降。1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml作用組分別下降為對照組的78.6％、50.0％、35.7％、14.3％。對照組的傷口幾乎完全愈合。 4.4小劑量EPI對MDA-MB-231細胞無明顯毒性作用: MTT實驗結果顯示，EPI不同濃度(1、2.5、5、10μg/ml)作用組的OD值分別為0.92

17、±0.26、0.91±0.35、0.97±0.06、0.89±0.21，與對照組(0.97±0.40)相比無明顯差異(P>0.05)。 結論: 1.Ezrin在乳腺導管癌的癌變中發(fā)揮一定作用。 2.Ezrin可以作為判斷乳腺浸潤性導管癌忠者預后的獨立指標，其強陽性表達提示預后差。 3.Ezrin表達與E-Cadherin表達呈負相關性，與CD44v6表達呈正相關性，可能借此參與調節(jié)腫瘤細胞的浸潤轉移。

18、 4 Ezrin蛋白的表達與人乳腺癌細胞的體外侵襲有關，阻斷Ezrin的表達，可以有效抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移。 5 RhoA可能作為Ezrin的上游信號轉導途徑參與調控腫瘤細胞的浸潤轉移。 6 小劑量表阿霉素能夠以劑量依賴性方式抑制乳腺癌細胞的遷移，這一作用不依賴其細胞毒性。 7小劑量表阿霉素能夠以劑量依賴性方式從基因和蛋白兩個水平抑制乳腺癌細胞Ezrin和CD44的表達，提高E-Cadherin的表達。