丁基苯酞對魚藤酮帕金森病模型保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：探討丁基苯酞（dl-3-n-Butylphthalide，NBP）對魚藤酮誘導的帕金森病細胞和動物模型的保護作用及其可能的機制。
　　 方法：（1）細胞實驗：分別使用終濃度為0.1 μM、1 μM、10 μM、100 μM NBP和溶劑二甲基亞砜（DMSO）預處理SH-SY5Y細胞24 h后，加入終濃度為200 nM的魚藤酮處理24 h建立多巴胺能細胞損傷模型。觀察細胞形態(tài)學變化，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測細胞

2、活性，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡與壞死（Hoechst33342/PI），流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率（Annexin V-FITC/PI）、線粒體膜電位（JC-1）、細胞內(nèi)活性氧水平（DCFH-DA）；（2）動物實驗：Sprague-Dawley大鼠單側(cè)黑質(zhì)致密部（SNc）和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）兩點立體定向注射魚藤酮制備帕金森病大鼠模型，隨機分組后，治療組采用NBP 80mg/kg/d連續(xù)灌胃給藥14 d。計數(shù)30 min內(nèi)阿撲嗎啡（A

3、PO）誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)；分光光度計測定中腦丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力；免疫組織化學染色測定黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（TH）及神經(jīng)細胞核（NeuN）雙重陽性細胞數(shù)量；（3）機制研究：在人神經(jīng)母細胞瘤多巴胺能的四種不同細胞系（SH-SY5Y細胞株、IMR-32細胞株、SK-N-AS細胞株及BE（2）-M17細胞株）中，100 μM NBP和DMSO分別加入上述培養(yǎng)的四種細胞系中作用24 h，免疫熒光染色測定α-突觸核蛋白（SN

4、CA）表達，實時熒光定量PCR檢測SNCA以及囊泡單胺轉(zhuǎn)運體（VMAT2） mRNA表達；在動物實驗中，隨機分組后，各組分別在處死前18 h和6 h腹腔注射NBP（80 mg/kg，NBP:DMSO:PBS=1:2:17）或溶劑（DMSO:H2O=3:17），免疫熒光染色測定VMAT2或SNCA表達，實時熒光定量PCR檢測SNCA以及VMAT2 mRNA表達。
　　 結(jié)果：200 nM魚藤酮處理SH-SY5Y細胞24 h能夠誘導

5、細胞活性下降和細胞凋亡。NBP預處理后，SH-SY5Y細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率明顯降低，線粒體膜電位顯著升高（P<0.05），細胞內(nèi)活性氧水平明顯降低（P<0.05），在一定濃度范圍內(nèi)，隨著NBP濃度的增加對SH-SY5Y細胞的保護作用增強。使用NBP治療魚藤酮誘導的帕金森病大鼠模型兩周，可明顯改善PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為（降低48％，與魚藤酮組相比，P<0.05），提高黑質(zhì)DA神經(jīng)元的存活率（增加30％，與魚藤酮組相比，P<0.05）以

6、及紋狀體DA神經(jīng)元的數(shù)目（增加49％，與魚藤酮組相比，P<0.05）。另外，在大鼠黑質(zhì)致密部及四種細胞系中，NBP組與溶劑對照組相比，SNCA蛋白的表達量無顯著性差異（P>0.05），VMAT2蛋白表達量增加了63.76％；實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，NBP組在SH-SY5Y細胞和IMR-32細胞中VMAT2 mRNA表達量分別增加了16.32％、39.39％；而在SK-N-AS細胞及BE（2）-M17細胞中NB

7、P對VMAT2 mRNA表達并無明顯影響。與溶劑對照組相比，NBP組在大鼠中腦黑質(zhì)致密部中VMAT2 mRNA表達量上調(diào)了38.35％（以GAPDH作內(nèi)參）和80.76％（以β-actin作內(nèi)參），而SNCA mRNA表達無明顯統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)論：NBP可明顯緩解魚藤酮在PD細胞模型和動物模型中誘導的損傷，可能通過抑制細胞發(fā)生凋亡、線粒體保護、抗自由基損傷、上調(diào)PD保護性基因VMAT2表達等機制實現(xiàn)，研究還發(fā)現(xiàn)NBP并不引