苯扎氯銨對角膜上皮屏障功能以及角膜內(nèi)皮間隙連接細胞通訊的影響及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行論述：
　　第一部分：局部應(yīng)用前列腺素類藥物對兔角膜上皮細胞屏障功能的影響
　　目的：苯扎氯銨(BAK)是滴眼液中最常用的防腐劑之一，大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)，局部長期使用含BAK的眼部制劑會出現(xiàn)很多眼部不適癥狀。含BAK的前列腺素類藥物是治療開角性青光眼的一線藥物，臨床上患者往往需要長期使用，易導(dǎo)致眼睛干澀，結(jié)膜充血等等，然而其作用機制還不是非常清楚。緊密連接與粘著連接等構(gòu)成了角膜上皮抵御外界病原微生物入

2、侵的第一道生理屏障，對角膜正常生理功能的維持具有非常重要的作用。本研究擬探討局部應(yīng)用前列腺素類藥物對角膜上皮細胞屏障功能的影響及其作用機制。
　　方法：新西蘭大白兔被隨機的分成4組，每組12只，右眼為藥物處理組，分別給以貝美前列腺素(0.005％ BAK)，曲伏前列腺素(0.015％ BAK)，拉坦前列腺素(0.02％ BAK)，以及0.02％ BAK，每日一次，持續(xù)30天給藥，對側(cè)未處理眼作為空白對照。Schimer實驗用以評估

3、用藥后淚液分泌的變化，裂隙燈顯微鏡下觀察角膜熒光染色、玫瑰紅染色以及BUT。運用活體共聚焦顯微鏡(IVCM)和蘇木素伊紅(HE)染色觀察角膜上皮細胞層、基質(zhì)層和內(nèi)皮細胞層的形態(tài)變化?？缒ど掀ぜ毎娮?TER)評估角膜上皮屏障功能，免疫熒光染色觀察緊密連接標志物ZO-1、occludin，粘著連接標志物β-catenin以及細胞增殖標志物ki67在角膜上皮細胞中的定位和表達。TNUEL凋亡試劑盒評估局部用藥后的角膜上皮細胞凋亡情況。

4、>　　結(jié)果：藥物處理30d后，貝美前列腺素與曲伏前列腺素實驗組的淚液分泌，BUT，角膜熒光素與玫瑰紅染色與空白對照組相比無顯著差異，而在0.02％ BAK與拉坦前列腺素實驗組中，淚液分泌減少，BUT縮短，角膜熒光素與玫瑰紅染色評分增加。HE染色檢測發(fā)現(xiàn)，藥物處理后，角膜形態(tài)無顯著變化。IVCM檢查證實，與空白對照組相比，不同前列腺素類藥物實驗組以及BAK處理組，角膜上皮淺表層細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細胞體積變大，形態(tài)變得不規(guī)則，基底層細

5、胞無顯著變化。在角膜基質(zhì)層，與對照組相比，前列腺素實驗組與BAK處理組的橋樣結(jié)構(gòu)顯著增多。與對照組相比，所有實驗組的角膜內(nèi)皮細胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均沒有明顯改變。在前列腺素類藥物實驗組，用藥5d后， TER呈現(xiàn)BAK濃度依賴性的下降，0.02％ BAK處理組下降最為顯著。藥物處理5d后， ZO-1和occludin在細胞膜上的分布破壞，而β-catenin的分布無明顯變化，用藥30d后，ZO-1和occludin以及β-catenin的形態(tài)與

6、結(jié)構(gòu)均發(fā)生了明顯的破壞。ki67在對照組和實驗組無明顯變化，TUNEL試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)，局部應(yīng)用前列腺素類藥物和BAK后，凋亡的上皮細胞數(shù)目明顯增多。
　　結(jié)論：局部應(yīng)用含BAK前列腺素類藥物會破壞角膜上皮細胞的屏障功能，進一步揭示了防腐劑BAK誘導(dǎo)眼表毒性的相關(guān)機制，為后續(xù)防腐劑的相關(guān)眼表毒性研究提供了很好的理論依據(jù)。
　　第二部分：防腐劑苯扎氯銨對兔角膜內(nèi)皮細胞間隙連接細胞通訊的影響及機制研究
　　目的：在正常生理狀

7、態(tài)下，角膜內(nèi)皮間隙連接形成的通道，可讓小分子營養(yǎng)物質(zhì)，信號分子和代謝產(chǎn)物通過，在維持角膜內(nèi)皮的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和新陳代謝中發(fā)揮著重要作用，同時角膜內(nèi)皮形成的屏障可有效阻止房水通過旁細胞通路進入角膜基質(zhì)，維持基質(zhì)的相對脫水狀態(tài)，因而間隙連接與內(nèi)皮屏障共同維持了角膜的透明和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。BAK是眼科最長用的防腐劑之一，長期使用含有BAK的滴眼液會出現(xiàn)很多眼部不適癥狀，如干眼，結(jié)膜鱗狀化生，細胞凋亡等。本研究主要探索局部應(yīng)用BAK對角膜內(nèi)皮間隙連接

8、細胞通訊的影響，并對相關(guān)機制進行探索。
　　方法：36只新西蘭大白兔被隨機的分成三組，右眼為藥物處理組，分別給以0.01％ BAK、0.05％ BAK以及0.1％ BAK，每日2次，持續(xù)給藥7d，對側(cè)未處理眼作為空白對照?；铙w共聚焦(IVCM)顯微鏡檢測角膜內(nèi)皮的形態(tài)變化，免疫熒光技術(shù)檢測間隙連接標志物Cx43在細胞中的定位和分布。TUNEL實驗檢測角膜內(nèi)皮細胞凋亡情況。Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測Cx43和緊密

9、連接標志物ZO-1的蛋白和基因表達水平。免疫沉淀技術(shù)和免疫熒光雙染色技術(shù)評估Cx43與ZO-1的相互作用。Scrape loading and dye transfer(SLDT)技術(shù)分析BAK對間隙連接細胞通訊活性的影響。
　　結(jié)果：局部使用0.05％ BAK和0.1％ BAK，破壞了間隙連接蛋白Cx43以及緊密連接標志物ZO-1在角膜內(nèi)皮細胞中的分布，同時下調(diào)了Cx43的蛋白表達水平。高濃度的BAK誘導(dǎo)Cx43發(fā)生磷酸化。免疫

10、熒光共染色和免疫沉淀結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BAK處理7d后，與對照組相比，Cx43與ZO-1的結(jié)合發(fā)生了破壞，相互作用顯著減弱。SLDT實驗發(fā)現(xiàn)，BAK處理后，間隙連接細胞通訊的活性（GJIC activity）顯著受到抑制。
　　結(jié)論：BAK通過磷酸化Cx43，破壞Cx43與ZO-1的相互作用，下調(diào)Cx43的蛋白表達水平，從而破壞角膜內(nèi)皮細胞的間隙連接細胞通訊。本研究第一次探討了BAK對角膜內(nèi)皮細胞間隙連接細胞通訊的影響，為眼科臨床如何合理