牙乳頭細胞對大鼠牙髓干細胞增殖及分化的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　牙病或外傷等原因引起的牙齒缺失可導致牙槽骨萎縮、相鄰牙齒松動脫落等癥狀，直接降低人們的生活質量和影響容貌美觀。活動義齒、固定義齒和種植義齒是最常見的修復缺失牙齒方法，然而他們各有弊病。近年來國內外學者已經成功地應用組織工程技術研制出具有生物活性的牙齒部分組織，選擇合適的細胞團或種子細胞是實現(xiàn)牙齒再生重建的前提。牙髓干細胞(Dental pulp stem cells，DPSCs)是牙髓組織中具有高度增殖、自我更新能力和

2、多相分化潛能的一類成體干細胞。DPSCs體外培養(yǎng)可分化為成牙本質樣細胞，并分泌牙本質或牙本質樣物質，復合到支架材料上可形成牙本質-牙髓樣組織。DPSCs作為組織工程的種子細胞之一，對牙齒的修復再生及牙齒組織工程相關研究具有重要意義。
　　Gronthos等將人的第三磨牙牙髓進行原代培養(yǎng)，分離DPSCs并將其置于含礦化液的培養(yǎng)液中，待形成礦化結節(jié)后將其與羥基磷灰石-磷酸三鈣(HA-TCP)支架復合，再將其移植到免疫缺陷小鼠的背部皮下

3、，6周后內形成牙本質樣結構環(huán)繞在牙髓樣組織周圍形成牙本質牙髓樣復合體。研究表明，影響DPSCs增殖分化的因素包括堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、骨形成蛋白(bone orphogeneticproteins，BMPs)、β-磷酸甘油、Dentonin等等。牙乳頭細胞也是組織工程牙齒的一類種

4、子細胞。牙髓牙本質復合體是形成牙齒的前體。而牙乳頭內含有向成牙本質細胞分化的前體細胞，即牙乳頭細胞可以作為牙髓牙本質復合體的前身。Kikuchi等研究表明牙乳頭中存在能分化為成牙本質細胞的干細胞。另有研究表明體外培養(yǎng)的牙乳頭細胞不僅可以分化為成牙本質細胞，還可以誘導形成成牙本質基質。增強種子細胞的增殖活性和分化能力是構建組織工程牙齒、推動牙齒再生研究的重要條件。DPSCs和牙乳頭細胞在適宜的誘導環(huán)境中增殖能力和礦化能力均較強，均有分化成

5、牙本質細胞的潛能，而牙乳頭細胞在體外與DPSCs分層混合培養(yǎng)對DPSCs增殖、分化能力的影響目前還未見報道。
　　DPSCs的增殖、分化受Notch、Wnt等多種信號轉導通路調節(jié)。Notch途徑是一種進化高度保守的細胞間信號途徑，主要作用是抑制各種干細胞的分化，促進其分裂增殖。研究表明，Notch信號分子通過和Delta或Jagged結合，影響DPSCs的增殖和分化，參與上皮細胞與問充質細胞間的通訊聯(lián)系，促進成釉細胞和成牙本質細胞

6、的分化。Wnt信號通路在牙齒發(fā)育的信號調控和牙齒再生等醫(yī)學工程研究中亦發(fā)揮重要作用。Wnt信號中的重要因子wnt-1，APC，β-catenin，E-cadherin可影響牙上皮和間充質的相互作用及牙本質與牙根的發(fā)育、增殖和分化。
　　本研究擬分離培養(yǎng)大鼠DPSCs與牙乳頭細胞，并建立DPSCs和牙乳頭細胞的分層共培養(yǎng)體系，探討大鼠牙乳頭細胞對DPSCs增殖及分化的影響及相關牙齒發(fā)育信號通路的機制研究。此研究國內外尚未見報道。我們

7、首先建立DPSCs和牙乳頭細胞的分層共培養(yǎng)體系，觀察體外分層共培養(yǎng)的細胞礦化結節(jié)形成情況，并利用流式細胞術檢測DPSCs的細胞周期，利用RT-PCR、免疫細胞熒光化學方法、Western blot檢測牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)、角蛋白(cytokeratin，CK)、Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ，COLⅠ)等基因與蛋白的表達，觀察分層共培養(yǎng)是否能促進這些成牙標志性蛋白的表達。明確

8、牙乳頭細胞是否可以促進DPSCs的增殖、分化，從而促進其成牙能力。最后研究DPSCs和牙乳頭細胞的分層共培養(yǎng)下，給予Notch信號通路抑制劑異硫氰酸苯已酯(PHI)和Wnt信號通路抑制劑Dickkopf-1(DKK-1)干預DPSCs，檢測DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ基因和蛋白的表達。并觀察細胞中Notch、Wnt信號通路中的信號分子Notch1、Notch2、Jagged1、wnt-1，APC，β-catenin基因和蛋白的表

9、達變化。本研究結果能夠明確大鼠牙乳頭細胞是否促進DPSCs的增殖與分化及其分子機制，這為牙齒再生的研究提供新的實驗依據(jù)和新思路。
　　方法：
　　1、DPSCs和牙乳頭細胞的分層共培養(yǎng)。
　　2、von Kossa礦化染色。
　　3、利用流式細胞術檢測DPSCs的細胞周期。
　　4、利用免疫細胞化學方法檢測DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ蛋白的表達。
　　5、RT-PCR法檢測DPSCs中DSPP

10、、CK、ColⅠ mRNA的表達。
　　6、Western blot法檢測DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ蛋白的表達。
　　7、DPSCs和牙乳頭細胞的分層共培養(yǎng)下，給予Notch信號通路抑制劑PHI和Wnt信號通路抑制劑DKK-1干預DPSCs，RT-PCR法和Western blot法檢測DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA和蛋白的表達。
　　8、DPSCs和牙乳頭細胞的分層共培養(yǎng)下，RT-PCR法和

11、Western blot法檢測細胞Notch信號通路中Notch1，Notch2，Jagged1，DLL1，Hes1 mRNA和蛋白表達。
　　9、DPSCs和牙乳頭細胞的分層共培養(yǎng)下，RT-PCR法和Western blot法檢測細胞Wnt信號通路中wnt-1，APC，β-catenin，E-cadherin mRNA和蛋白表達。
　　結果：
　　1、分層共培養(yǎng)14天后，DPSCs中可觀察到明顯的礦化結節(jié)。
　

12、　2、流式細胞術結果顯示分層共培養(yǎng)可促進DPSCs的增殖。
　　3、分層共培養(yǎng)細胞5天后，DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA的表達顯著增加。
　　4、DPSCs和牙乳頭細胞的分層共培養(yǎng)下，給予PHI和DKK-1干預DPSCs，RT-PCR法和Western blot法結果顯示DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA和蛋白的表達顯著下降。
　　5、DPSCs和牙乳頭細胞的分層共培養(yǎng)下，RT-PCR法和W

13、estern blot法顯示細胞Notch信號通路中Notch1，Notch2，DLL1，Jagged1，Hes1 mRNA和蛋白表達增強。
　　6、DPSCs和牙乳頭細胞的混合培養(yǎng)下，RT-PCR法和Western blot法顯示細胞Wnt信號通路中wnt-1，β-catenin mRNA和蛋白表達增強;E-cadherin，APCmRNA和蛋白表達和對照組比較無統(tǒng)計學意義。
　　討論：
　　本實驗結果顯示大鼠牙乳頭

14、細胞和DPSCs分層共培養(yǎng)14天后，DPSCs中可觀察到明顯的礦化結節(jié)，分層共培養(yǎng)組細胞的增殖較單純DPSCs培養(yǎng)對照組增殖顯著旺盛，即牙乳頭細胞和DPSCs分層共培養(yǎng)可促進DPSCs的增殖。利用RT-PCR、免疫細胞熒光化學方法、Western blot證實了牙乳頭細胞和DPSCs分層共培養(yǎng)可增加成牙標志性蛋白DSPP、CK、COLⅠ mRNA和蛋白的表達。該結果首次證明牙乳頭細胞可以促進DPSCs的增殖、分化，從而促進其成牙能力。同

15、時本研究結果顯示給予Notch信號通路抑制劑PHI和Wnt信號通路抑制劑DKK-1干預DPSCs，DSPP、CK、ColⅠ基因和蛋白的表達減弱，提示Notch和Wnt信號通路可能參與了牙乳頭細胞促進DPSCs的增殖、分化。本研究結果并進一步明確牙乳頭細胞可能促進Notch信號通路中的信號分子Notch1，Notch2，DLL1，Jagged1，Hes1及Wnt信號通路中的信號分子wnt-1，β-catenin表達上調誘導DPSCs的增殖

16、與分化。
　　恒牙出現(xiàn)缺損缺失時，需要以人工修復體恢復口腔功能和面容美觀。隨著生物組織工程技術的進步，人們開始設想如何對牙齒能夠進行生物克隆或再生，干細胞理論、組織重組以及生物支架材料的應用，使人們有了希望去實現(xiàn)牙齒再生。2000年Gronthos等人成功的從人牙髓組織中提取出具有克隆源性且能快速增殖的DPSCs細胞群，將其種植于免疫缺陷小鼠的體內，可以培養(yǎng)出牙本質牙髓樣物質。
　　綜上所述，本研究結果證明大鼠牙乳頭細胞和D

17、PSCs分層共培養(yǎng)，牙乳頭可能分泌一些可溶性因子促進DPSCs的增殖、礦化與分化，并增加成牙標志性蛋白DSPP、CK、COLⅠ mRNA和蛋白的表達;Notch和Wnt信號通路可能參與了牙乳頭細胞促進DPSCs的增殖、分化的過程。
　　結論：
　　1、牙乳頭細胞和DPSCs分層共培養(yǎng)可促進DPSCs礦化、增殖及分化
　　2、牙乳頭細胞和DPSCs分層共培養(yǎng)可促進DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA和蛋白的表達

18、。
　　3、DPSCs和牙乳頭細胞分層共培養(yǎng)時可能通過激活Notch、Wnt信號通路，促進DPSCs的增殖、分化。
　　4、DPSCs和牙乳頭細胞分層共培養(yǎng)時可能通過激活Notch信號通路中Notch1，Notch2，DLL1，Jagged1，Hes1 mRNA和蛋白表達促進DPSCs的增殖、分化。
　　5、DPSCs和牙乳頭細胞分層共培養(yǎng)時可能通過激活Wnt信號通路wnt-1，β-catenin mRNA促進DPSC