川芎α-淀粉酶-枯草桿菌蛋白酶抑制劑基因(LASI)的克隆、表達與分析.pdf

1、川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)為四川省著名的道地藥材，具有祛風(fēng)止痛、活血行氣的功效，其指標成分為川芎嗪和阿魏酸，常用于治療心腦血管、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等方面的疾病。目前已從多種植物中分離得到α-淀粉酶抑制劑，其在減肥、降血脂、治療糖尿病和抗蟲害等方面都有應(yīng)用。
　　本課題以川芎根莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選出一條可能的α-淀粉酶抑制劑基因。采用RACE技術(shù)成功擴增出該基因的全長序列，命名為Ligustic

2、um chuanxiongα-amylaseInhibitor(LASI)?；蛐蛄猩蟼髦罭CBI GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KX580040。
　　對LASI蛋白的基本性質(zhì)分析結(jié)果顯示:LASI基因全長860bp，含612bp的CDS，編碼203aa的蛋白質(zhì)。其相對分子質(zhì)量為22570Da，理論等電點為5.06，無明顯的親疏水性。LASI的1-23位氨基酸殘基為信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位于胞外。通過與其他植物的α-淀粉

3、酶抑制劑和胰蛋白酶抑制劑進行多序列比對后發(fā)現(xiàn)，LASI屬于Kuntize型α-淀粉酶抑制劑，具有α-淀粉酶抑制劑和枯草桿菌蛋白酶抑制劑活性。LASI具有保守的Thr88和Glu194殘基，是其發(fā)揮枯草桿菌蛋白酶抑制活性和淀粉酶抑制活性的關(guān)鍵位點。分子進化樹顯示LASI與水稻中發(fā)現(xiàn)的RASI具有較高的同源性。LASI基因與大腸桿菌E.Coil的密碼子偏好性不存在較大差異，說明LASI蛋白可以通過E.Coil進行原核表達。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示延

4、伸鏈、無規(guī)則卷曲、α螺旋和β轉(zhuǎn)角分別占33.50％、31.53％、21.67％和13.30％。以RASI為模板進行同源建模，獲得LASI三維結(jié)構(gòu)的初始模型，并進行能量最小化和分子動力學(xué)模擬優(yōu)化，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。
　　首次構(gòu)建了LASI-pET28a重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進大腸桿菌Rosetta后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功表達出了一條23kDa的重組LASI蛋白。對重組蛋白的誘導(dǎo)表達條件進行優(yōu)化，確定了最佳溫度、誘導(dǎo)時間和IPTG濃度。

5、對重組蛋白的可溶性進行檢測，利用NI2+親和層析柱對重組LASI蛋白進行純化，成功獲得高純度的重組LASI蛋白，經(jīng)過質(zhì)譜檢測，證實為LASI蛋白。
　　通過碘-淀粉呈色法和Erlanger法等檢測LASI蛋白對豬、人、小菜蛾、棉鈴蟲、斜紋夜蛾淀粉酶以及枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LASI是哺乳動物淀粉酶的弱抑制劑，鱗翅目害蟲淀粉酶的強抑制劑，其對枯草桿菌蛋白酶也具有較強的抑制作用，但對胰蛋白酶、胰凝乳