川芎α-淀粉酶-枯草桿菌蛋白酶抑制劑基因(LASI)的克隆、表達與分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)為四川省著名的道地藥材,具有祛風止痛、活血行氣的功效,其指標成分為川芎嗪和阿魏酸,常用于治療心腦血管、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等方面的疾病。目前已從多種植物中分離得到α-淀粉酶抑制劑,其在減肥、降血脂、治療糖尿病和抗蟲害等方面都有應用。
  本課題以川芎根莖轉錄組數(shù)據(jù)為基礎,篩選出一條可能的α-淀粉酶抑制劑基因。采用RACE技術成功擴增出該基因的全長序列,命名為Ligustic

2、um chuanxiongα-amylaseInhibitor(LASI)?;蛐蛄猩蟼髦罭CBI GenBank數(shù)據(jù)庫,登錄號為KX580040。
  對LASI蛋白的基本性質分析結果顯示:LASI基因全長860bp,含612bp的CDS,編碼203aa的蛋白質。其相對分子質量為22570Da,理論等電點為5.06,無明顯的親疏水性。LASI的1-23位氨基酸殘基為信號肽,無跨膜結構域,亞細胞定位于胞外。通過與其他植物的α-淀粉

3、酶抑制劑和胰蛋白酶抑制劑進行多序列比對后發(fā)現(xiàn),LASI屬于Kuntize型α-淀粉酶抑制劑,具有α-淀粉酶抑制劑和枯草桿菌蛋白酶抑制劑活性。LASI具有保守的Thr88和Glu194殘基,是其發(fā)揮枯草桿菌蛋白酶抑制活性和淀粉酶抑制活性的關鍵位點。分子進化樹顯示LASI與水稻中發(fā)現(xiàn)的RASI具有較高的同源性。LASI基因與大腸桿菌E.Coil的密碼子偏好性不存在較大差異,說明LASI蛋白可以通過E.Coil進行原核表達。二級結構預測顯示延

4、伸鏈、無規(guī)則卷曲、α螺旋和β轉角分別占33.50%、31.53%、21.67%和13.30%。以RASI為模板進行同源建模,獲得LASI三維結構的初始模型,并進行能量最小化和分子動力學模擬優(yōu)化,為下一步的研究奠定基礎。
  首次構建了LASI-pET28a重組質粒,轉化進大腸桿菌Rosetta后,經(jīng)IPTG誘導,成功表達出了一條23kDa的重組LASI蛋白。對重組蛋白的誘導表達條件進行優(yōu)化,確定了最佳溫度、誘導時間和IPTG濃度。

5、對重組蛋白的可溶性進行檢測,利用NI2+親和層析柱對重組LASI蛋白進行純化,成功獲得高純度的重組LASI蛋白,經(jīng)過質譜檢測,證實為LASI蛋白。
  通過碘-淀粉呈色法和Erlanger法等檢測LASI蛋白對豬、人、小菜蛾、棉鈴蟲、斜紋夜蛾淀粉酶以及枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性。結果發(fā)現(xiàn)LASI是哺乳動物淀粉酶的弱抑制劑,鱗翅目害蟲淀粉酶的強抑制劑,其對枯草桿菌蛋白酶也具有較強的抑制作用,但對胰蛋白酶、胰凝乳

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