人腦星形細胞腫瘤VEGF分布與微血管構筑關系的定量病理學研究.pdf

1、星形細胞腫瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的膠質(zhì)瘤類型，其血管生成活躍。血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial.growthfactor,VEGF)是血管生成中起主要作用并研究的最為深入的血管生成因子之一，它與其受體結合后促進血管內(nèi)皮細胞增殖分化、血管重塑而致血管生成。腫瘤內(nèi)VEGF表達以及微血管密度(microvesseldensity,MVD)的測定可作為判斷腦星形細胞瘤惡性潛能的重要生物學指標和病理診斷、預后判斷指標

2、，檢測VEGF的表達狀態(tài)對進一步認識腫瘤血管形成的機制有重要作用。腫瘤問質(zhì)中新生微血管的密度、形態(tài)、結構(組成)及其隨腫瘤演進在瘤組織內(nèi)的三維分布可統(tǒng)稱為“腫瘤微血管構筑表型”(tumormicrovasculararchitecturephenotype，T-MAP)。研究發(fā)現(xiàn)在癌前病變與癌之間、原發(fā)瘤與轉移瘤之間T-MAP存在差異；另一方面，抗癌藥治療的過程對微血管構筑也有明顯影響，提示T-MAP在腫瘤學上有重要意義。T-MAP的多

3、樣性和差異性統(tǒng)稱為T-MAP異質(zhì)性(T-MAPheterogeneity，T-MAPH)。組織芯片(tissuechips)，或稱組織微陣列(tissuemicroarray)，是將數(shù)十個甚至上千個不同病人的組織標本集成在一張固相載體上所形成的組織微陣列。組織芯片為醫(yī)學分子生物學提供一種高量、大樣本以及快速的分子水平分析工具。它克服了傳統(tǒng)病理學制樣方法中存在的操作復雜、自動化程度低、檢測效率低等缺陷，可有效利用成百上千份自然或處于疾病狀

4、態(tài)下的組織標本來研究特定基因及其所表達的蛋白質(zhì)與疾病之間的相關關系。組織芯片技術以其高通量的特性使得科研人員能同時對大量標本的基因、基因轉錄及蛋白表達水平進行研究并能進行很好的質(zhì)控，從而提高研究結果的可靠性。因此，利用免疫組織化學雙染技術在組織芯片上定量分析微血管構筑參數(shù)以及VEGF表達情況，能對膠質(zhì)瘤的診斷、療效評估等提供客觀的依據(jù)，為腫瘤的抗血管生成治療的新思路、新策略提供理論基礎。圖像分析技術可以間接地反映腫瘤細胞生物學行為的改變

5、，成為一項非常便捷的分析檢測技術。 腫瘤血管生成中，T-MAPH還包括血管構成的三維形態(tài)，在普通光學顯微鏡下，很難觀察到微血管構筑的三維形態(tài)，而在計算機輔助三維重建技術產(chǎn)生并實用化后，利用組織連續(xù)切片對腫瘤不同發(fā)展階段腫瘤組織中的微血管內(nèi)皮細胞的分布情況進行三維重建，并對T-MAPH的三維形態(tài)進行觀察和測量，從而從空間構型上實現(xiàn)顯示組織中微血管內(nèi)皮細胞，在深入探討細胞因子與血管生成以及臨床預后、療效評估等各方面中有著重要的意義。

6、 本研究以在本科室前期完成的含有不同級別和不同微血管形態(tài)的星形細胞腫瘤組織組織芯片的基礎上，應用免疫雙標技術和圖像分析方法對微血管數(shù)目、微血管平均周長和VEGF陽性單位(positiveunit,PU)值進行定量分析，且應用三維重建技術對總厚度為320μm的腫瘤組織連續(xù)切片中CD34陽性內(nèi)皮細胞的空間分布進行重建，并對所獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理和應用數(shù)學軟件進行分析。主要結果和結論如下： 一、對人腦星形細胞腫瘤組織芯片進行

7、CD34/VEGF免疫組織化學雙標和圖像分析及統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)VEGFPU值、微血管密度隨腫瘤的級別升高而增大，而腫瘤中微血管的平均周長隨之減小 在本科室前期完成的168點陣組織芯片(80例人腦星形細胞腫瘤，其中彌漫性星形細胞瘤31例，問變性星形細胞瘤32例，膠質(zhì)母細胞瘤17例；所制芯片點陣排列為薄壁血管WHOII級43點、WHOⅢ級38點、WHOⅣ級23點；厚壁血管WHOⅢ級24點、WHOⅣ級16點；腎小球樣血管wHOⅣ級11點；

8、血管心假菊形團樣結構血管WHOII級1點、WHOⅢ級2點、WHOⅣ2點)上進行CD34和VEGF雙標記，并在此基礎上利用圖像分析軟件ImageProPlus5.1中文版對微血管構筑參數(shù)和VEGF的表達進行定量分析，結果顯示，膠質(zhì)瘤組織中VEGFPU值和微血管密度隨著腫瘤級別的增高而增大，各級別之間有顯著性差異；血管平均周長隨著腫瘤級別的增高而減小，問變性星形細胞瘤和膠質(zhì)母細胞瘤無顯著差異，兩者分別與彌漫性星形細胞瘤之間有顯著差異，這與既

9、往定性分析結果吻合[1,18-22]。結果說明，微血管密度、血管平均周長能作為微血管構筑參數(shù)應用；在膠質(zhì)瘤血管生成和級別判定中可客觀的運用VEGFPU值。 二、星形細胞腫瘤中VEGF的表達量和分布存在不同的模式，它不僅促進了血管生成，而且與微血管分布之間存在數(shù)學模型關系。 采用免疫組織化學雙重染色技術分別標記星形細胞瘤組織芯片中(CD34和VEGF，采集染色結果，選擇不同級別的單個點陣，并隨機選取其中圓度為1.000～1

10、.350的微血管，利用圖像分析軟件對血管周圍各點的VEGF進行光密度測定以及點坐標定位，通過計算和分析，建立VEGF濃度梯度與離壁距離的數(shù)學方程式。結果表明：VEGF在瘤組織內(nèi)的分布與新生微血管的分布和形態(tài)有密切關系，選定范圍內(nèi)(離壁距離0～8μm)測定點的VEGF光密度值(濃度，y)與該點到血管壁的距離(x)的數(shù)學關系模型為：Y=1/√45.1+6.06x(相關系數(shù)R＝0.6124，P＜0.001)。在不同星形細胞腫瘤中VEGF的表達

11、量和分布存在不同的模式，這表明VEGF不僅促進了血管生成，而且與微血管分布之間有數(shù)學模型關系 三、采用三維重建技術構建出腫瘤微血管內(nèi)皮細胞的空間分布 應用計算機三維重建軟件3DDOCTOR對人腦彌漫性星形細胞瘤連續(xù)切片中不同區(qū)域的CD34陽性細胞進行三維重建，成功構建了星形膠質(zhì)細胞瘤部分微血管內(nèi)皮的三維結構，結果顯示星形細胞腫瘤內(nèi)微血管分枝而不均一，甚至部分血管有扭曲走向，以大量新生的幼稚毛細血管為主，同時存在管腔較大的

12、微血管、微血管出芽生成的單盲端血管以及單個內(nèi)皮細胞聚集成索狀的現(xiàn)象。惡性星形細胞腫瘤的微血管不僅豐富，而且具有形態(tài)結構的多樣性和異質(zhì)性，這一特點對于認識惡性腫瘤血管生成三維結構特性、構建數(shù)字化虛擬腫瘤微血管模型及其在抗血管生成治療上可能有重要意義。 本研究的意義： 腫瘤微血管構筑表型異質(zhì)性的存在，與腫瘤細胞分泌的生長因子尤其是VEGF構成的微環(huán)境對微血管內(nèi)皮異質(zhì)性存在著調(diào)控作用，因此研究微血管周圍VEGF的分布與微血管之