櫛孔扇貝fosmid文庫的構(gòu)建及基因組結(jié)構(gòu)特征分析.pdf

1、本研究構(gòu)建了第一個(gè)櫛孔扇貝的fosmid基因組文庫，對(duì)文庫的部分克隆進(jìn)行了兩末端測(cè)序和序列分析，并對(duì)部分克隆進(jìn)行了染色體定位。主要結(jié)果如下： 1、櫛孔扇貝fosmid基因組文庫的構(gòu)建和鑒定本研究構(gòu)建了第一個(gè)櫛孔扇貝的fosmid基因組文庫，該文庫包含133，851個(gè)克隆。對(duì)隨機(jī)挑取的80個(gè)克隆的限制性酶切分析表明，克隆的空載率低于1.25％，克隆的插入片段大小分布在30-45 kb，插入片斷平均長度為40 kb。該文庫覆蓋櫛孔扇

2、貝基因組的4．3倍，得到任意單拷貝DNA序列的概率為98．7％。fosmid克隆的穩(wěn)定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明櫛孔扇貝DNA在fosmid傳代中表現(xiàn)得較為穩(wěn)、定，沒有發(fā)現(xiàn)插入片段的丟失或重排。為了方便后續(xù)的PCR篩選，我們對(duì)所有的克隆進(jìn)行了超級(jí)池和二級(jí)池的構(gòu)建，并利用所構(gòu)建的超級(jí)池和二級(jí)池篩選了2個(gè)基因和7個(gè)微衛(wèi)星，結(jié)果陽性克隆數(shù)介于2到8之間。由此可見，該文庫可以很好的用于目的基因或標(biāo)記的篩選，將有利于物理作圖和基因的圖位克隆研究。 2

3、、櫛孔扇貝fosmid末端序列分析隨機(jī)挑取2，016個(gè)克隆進(jìn)行雙末端測(cè)序，獲得3，646條序列。序列總長2，286，986 bp，大約占櫛孔扇貝基因組的1．84‰。對(duì)這些序列進(jìn)行如下分析： 首先，利用Tandem Repeats Finder(TRF)軟件進(jìn)行串聯(lián)重復(fù)序列的查找，結(jié)果共得到2，500條重復(fù)序列，其中微衛(wèi)星序列371條，小衛(wèi)星序列1，816條，衛(wèi)星序列313條，分別占串聯(lián)重復(fù)序列總數(shù)的14．84％，72．64％，1

4、2．52％。從長度上看，所有串聯(lián)重復(fù)序列總長552，558 bp，其中微衛(wèi)星序列9，425 bp，小衛(wèi)星序列336，001 bp，衛(wèi)星序列207，132 bp，分別占串聯(lián)重復(fù)序列總長的1．71％，60．81％，37．49％，占測(cè)序總長的0．41％，14．69％，9．06％。 其次，通過在線服務(wù)器RepeatMasker查找，共得到317條散布重復(fù)序列，總長97，412 bp，占測(cè)序總長的4．26％。查找到的散布重復(fù)序列共有4種類

5、型：DNA轉(zhuǎn)座子、LTR反轉(zhuǎn)座子、LINE反轉(zhuǎn)座子和滾環(huán)轉(zhuǎn)座子。其中LINE反轉(zhuǎn)座子的數(shù)目最多，其次是LTR反轉(zhuǎn)座子，DNA轉(zhuǎn)座子和滾環(huán)轉(zhuǎn)座子。從重復(fù)序列的長度上看，LTR反轉(zhuǎn)座子最長，其次是LINE反轉(zhuǎn)座子，DNA轉(zhuǎn)座子和滾環(huán)轉(zhuǎn)座子。由此可見，櫛孔扇貝基因組中反轉(zhuǎn)座子所占比例要遠(yuǎn)高于DNA轉(zhuǎn)座子。最后， BLAST比對(duì)結(jié)果表明在3，646條序列中，有1，383條序列與數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的序列有明顯的相似性(E)，占測(cè)序總數(shù)的37

6、.9396。BASTN比對(duì)有明顯相似性的1，036條序列中，與nr數(shù)據(jù)庫序列相似的有113條，與EST數(shù)據(jù)庫序列相似的有923條。BLASTX比對(duì)有明顯相似性的序列有347條，占序列總數(shù)的9.5296。 3、櫛孔扇貝fosmid克隆的染色體定位分析根據(jù)對(duì)fosmid兩端序列的分析和PCR篩選文庫的結(jié)果，我們選擇了12個(gè)克隆進(jìn)行FISH定位。其中8個(gè)克隆為重復(fù)序列，有4個(gè)有單一的染色體定位，其余4個(gè)克隆在染色體上的位置不單一，出現(xiàn)

7、在幾條甚至所有染色體上。剩余的4個(gè)克隆據(jù)分析有可能是單拷貝或低拷貝序列，我們嘗試對(duì)它們進(jìn)行染色體定位。當(dāng)沒有C<,o>t-1 DNA封阻時(shí)，背景很高；但加入C<,o>t-1 DNA封阻后，其中的3個(gè)克隆信噪比提高，可以確定陽性信號(hào)的位置。最終，12個(gè)克隆中有11個(gè)成功得以定位，去除3個(gè)不適合用于染色體鑒定的克隆，其余8個(gè)克隆成功實(shí)現(xiàn)了8條染色體的區(qū)分鑒定。這將有利于櫛孔扇貝細(xì)胞遺傳學(xué)研究，比如染色體重排，基因的染色體定位，染色體特異性文