骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞誘導分化中免疫性發(fā)育的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是由于圍產(chǎn)期各種因素導致的胎兒或新生兒缺氧、缺血引起腦組織損傷。盡管當今圍產(chǎn)醫(yī)學迅速發(fā)展,但HIBD仍是引起新生兒死亡、影響新生兒正常發(fā)育、導致兒童腦癱、精神發(fā)育遲滯、學習障礙和癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的主要原因(Spong,2005)。目前臨床上缺少特異性的有效手段治療HIBD(韓玉昆,2000)。間充質(zhì)干細胞移植為臨床治療HIBD開辟了一條嶄新的

2、途徑。但是,由于缺氧、缺血損傷導致腦組織彌漫性病變,腦內(nèi)的動態(tài)免疫平衡遭到破壞,是否會誘發(fā)對植入細胞的免疫排斥反應呢? 本試驗旨在觀察骨髓MSCs向神經(jīng)細胞誘導分化中的免疫學特性發(fā)育,以及HIBD模型小鼠腦內(nèi)移植后的免疫反應,為骨髓MSCs移植治療新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)提供技術平臺。 試驗分為以下三個部分: 一、骨髓MSCs向神經(jīng)細胞分化中的免疫原性

3、發(fā)育。 目的:探討骨髓MSCs向神經(jīng)細胞分化后的移植免疫表型及其對同種異體T細胞增殖的作用。 方法:體外分離和培養(yǎng)人骨髓MSCs。用加入堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和表皮生長因子(epidermalgrowth factor,EGF)的無血清培養(yǎng)基將MSCs誘導分化1周~2周;免疫熒光法和免疫印跡法進行細胞性質(zhì)鑒定。將細胞分為未分化的MSCs組(MSCs組)

4、、MSCs向神經(jīng)誘導分化1周的細胞組(Neu1組)和MSCs向神經(jīng)誘導分化2周的細胞組(Neu2組)。流式細胞技術和免疫印跡法檢測各組細胞免疫表型;各組細胞分別與同種異體的T細胞共培養(yǎng),β液閃儀檢測T細胞增殖。比較γ-IFN100U/ml預處理48小時前后各組細胞的免疫表型和對T細胞的增殖作用。用spss11.0軟件包及Exce17.0分析統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果:原代分離的骨髓為形態(tài)不均一的細胞。經(jīng)傳代4次后,細胞形態(tài)均一

5、。對傳4代以上的細胞行流式細胞儀檢測,結(jié)果示陽性表達CD29,CD105,CD44;陰性表達CD34,CD14,CD45,說明培養(yǎng)的細胞表達間充質(zhì)干細胞的表面標志,而不表達造血干細胞、內(nèi)皮祖細胞的表面標志。將MSCs加入含bFGF、EGF的DMEM/F12(1:1)無血清培養(yǎng)基進行誘導分化。部分細胞5~7天后胞質(zhì)向胞核收縮,胞體變小,變成多角形和不規(guī)則形。14天后可見部分回縮的胞體延縱軸伸出長長的突起,交織成網(wǎng)狀。間接免疫熒光法檢測顯示

6、,誘導前部分骨髓MSCs表達nestin,基本不表達神經(jīng)元特異性烯醇酶(neuron specificenolase,NSE)、神經(jīng)微絲(neurofilament,NF-L)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP);誘導分化2周時,細胞表達nestin、NSE和NF-L顯著增加。GFAP在誘導分化2周的細胞中仍基本不表達。免疫印跡法檢測得到相似結(jié)果。以上結(jié)果表明MSCs主要向神經(jīng)元

7、分化。流式細胞技術檢測發(fā)現(xiàn),誘導前MSCs組表達HLA-Ⅰ類分子的經(jīng)典基因HLA-A,B,C,不表達HLA-Ⅱ類分子的經(jīng)典基因HLA-DR和共刺激分子。誘導1周時和誘導2周時HLA-A,B,C、HLA-DR.和共刺激分子CD80表達增加。各組間.P<0.05,有顯著性差異。然而,流式細胞技術和免疫印跡檢測顯示誘導2周后CD40和CD86仍無表達。γ-IFN預處理后,MSCs組、Neu1組和INeu2組表達HLA-A,B,C和HLA-DR

8、表達明顯增加。與未經(jīng)γ-IFN預處理的MSCs組、Neu1組和Neu2組相比,HLA分子的表達差異有顯著意義(P<0.05)。但是,流式細胞技術和免疫印跡法檢測均顯示,γ-IFN預處理前后共刺激分子CD40、CD80和CD86表達無明顯改變。各組細胞分別與同種異體T細胞共培養(yǎng)6天后,結(jié)果顯示MSCs抑制T細胞增殖,并且隨著MSCs向神經(jīng)細胞分化,抑制作用明顯增強,各組間有顯著性差異,P<0.05。 結(jié)論:骨髓MSCs向神經(jīng)細胞誘

9、導分化后,細胞表達HLA分子和共刺激分子CD80增加,不能表達共刺激分子CD40和CD80,并且抑制T細胞增殖,提示細胞免疫原性低,有成熟的趨勢。 二、向神經(jīng)細胞誘導分化中的骨髓MSCs對同種異體T細胞的免疫調(diào)節(jié)作用。 目的:探討骨髓MSCs向神經(jīng)細胞分化后對同種異體T細胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其可能機制。 方法:骨髓MSCs原代分離、培養(yǎng)并向神經(jīng)細胞誘導分化。MSCs向神經(jīng)誘導分化后的細胞分組同第一部分。體外分離同種

10、異體T細胞。向植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)刺激同種異體T細胞增殖的培養(yǎng)體系中,加入MSCs向神經(jīng)誘導分化后的各組細胞,進行共培養(yǎng)。比較γ-IFN100U/ml預處理48小時前后各組細胞對PHA刺激同種異體T細胞增殖的作用。采用transwell培養(yǎng)板分隔MSCs向神經(jīng)誘導分化后的細胞和PHA刺激的同種異體T細胞培養(yǎng)體系。均用β液閃儀檢測T細胞增殖。 結(jié)果:與Con組比較,MSCs組、Neur1組和N

11、eur2組細胞抑制PHA刺激的非特異性淋巴細胞增殖作用,各組間P<0.05,有顯著性差異。隨著MSCs向神經(jīng)細胞分化,體外試驗中其抑制由PHA刺激的非特異性淋巴細胞增殖作用增強。γ-IFN預處理后,MSCs組、Neu1組和Neu2組細胞對非特異性淋巴細胞增殖的抑制作用增強。與未經(jīng)γ-IFN預處理的三組細胞分別進行配對t檢驗,均為P<0.05。與直接接觸培養(yǎng)的各組細胞比較,采用Transwell非接觸性培養(yǎng)對T細胞增殖無顯著影響(P>0.

12、05)。 結(jié)論:骨髓MSCs向神經(jīng)誘導分化后的細胞抑制PHA刺激的T淋巴細胞增生;細胞分泌可溶性細胞因子是MSCs向神經(jīng)誘導分化后的細胞抑制PHA刺激的T細胞增生的可能機制。 三、缺氧缺血腦損傷模型腦內(nèi)移植向神經(jīng)細胞誘導分化的骨髓MSCs的免疫排斥反應。 目的:探討向神經(jīng)細胞誘導分化的骨髓MSCs移植至HIBD模型腦內(nèi)后的免疫排斥反應。 方法:7日齡新生昆明小鼠,隨機分為:正常對照組(Con組)、HIBD

13、模型組(HIBD組)、未分化MSCs移植組(MSCs組)、MSCs誘導分化1周細胞移植組(Yeu1組)、MSCs誘導分化2周細胞移植組(Neu2組)。每組動物12只。根據(jù)Ditelberg(1996)報道方法制作新生小鼠HIBD模型。各移植組小鼠10日齡時,給予腦內(nèi)移植1×10<'5>個細胞骨髓MSCs細胞懸液。采用神經(jīng)行為學評分和腦組織病理學分析觀察腦內(nèi)移植的療效。免疫熒光法檢測移植細胞HLA DR的表達和腦組織內(nèi)樹突狀細胞的標志物C

14、D11C和巨噬細胞標志物Mac-1的表達。 結(jié)果:與正常對照組比較,HIBD組在T迷宮強迫改變試驗、放射臂迷宮試驗和足錯誤試驗中,表現(xiàn)明顯不足。MSCs組、Neu1組和Neu2組的各項行為學測試結(jié)果較HIBD組均有明顯改善。MSCs組、Neu1組和Neu2組三組間無明顯差異。HIBD后4周,處死小鼠,并取腦。IUBD組、MSCs組、Neu1組、Neu2組可見左腦萎縮,Con組鼠腦未見明顯異常。小鼠腦組織切片HE染色后光學顯微鏡下

15、觀察,Con組皮層神經(jīng)元分布整齊,海馬CA1區(qū)細胞排列整齊;HIBD組可見大腦皮層神經(jīng)元丟失,海馬CA1區(qū)細胞排列紊亂;MSCs組、Neu1組和Neu2組的神經(jīng)元損傷較HIBD組有明顯改善;MSCs組、Neu1組和Neu2組三組間的神經(jīng)元損傷無明顯差異。移植后1周,HLA Ⅱ類分子陽性率均低;移植后2周、4周,HLA DR陽性率增高;與MSCs組比較,Neu2組HLA DR陽性率顯著增高。Con組基本不表達CD11C和Mac-1:HIB

16、D組低水平表達CD11C和Mac-1;MSCs組、Neu1組和Neu2組均可見CD11C和Mac-1陽性細胞,其中Neu2組表達較明顯。結(jié)論:腦內(nèi)移植MSCs及其向神經(jīng)誘導分化的細胞可以改善HIBD模型小鼠的神經(jīng)功能損傷。移植MSCs與其向神經(jīng)誘導分化后的細胞移植比較,對HIBD模型的療效無明顯差異。MSCs及其向神經(jīng)分化細胞HIBD腦內(nèi)移植后,移植細胞免疫原性增強,腦內(nèi)樹突狀細胞和巨噬細胞聚集,可誘發(fā)免疫排斥反應。 結(jié)論:

17、 1.在體外,雖然骨髓MSCs免疫原性低,但是隨著其向神經(jīng)細胞誘導分化,免疫原性呈現(xiàn)增強的趨勢; 2.向神經(jīng)細胞誘導分化的骨髓MSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用; 3.分泌可溶性細胞因子是向神經(jīng)細胞誘導分化的MSCs抑制PHA刺激的T細胞增生的可能機制之一; 4.腦內(nèi)移植向神經(jīng)細胞誘導分化的MSCs可以改善HIBD模型的神經(jīng)功能損傷,移植不同誘導分化程度的細胞對改善HIBD模型神經(jīng)功能損傷的作用無明顯不同; 5

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