乙肝陽性肝移植病人外周血中HBV特異性CTL頻度和急性排斥發(fā)生關(guān)系.pdf

1、盡管免疫抑制劑的發(fā)展使器官移植取得了很大的進(jìn)步，移植后急性排斥反應(yīng)仍是肝移植術(shù)后的主要障礙之一，長(zhǎng)期大量使用免疫抑制劑對(duì)各器官遠(yuǎn)期功能不利已經(jīng)成為共識(shí)，維持什么水平的免疫抑制甚至是否撤除免疫抑制以及何時(shí)撤除免疫抑制?這些問題的解決必須建立在對(duì)排斥機(jī)制、預(yù)測(cè)排斥發(fā)生的特異性指標(biāo)和影響排斥反應(yīng)的因素等充分了解的基礎(chǔ)上。因?yàn)榧?xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在抑制病毒感染、抗腫瘤、急性同種移植排斥反應(yīng)等免疫應(yīng)答中起主要作用，而我國接受肝移植的病人大多為乙肝患

2、者，乙肝陽性肝移植病人外周血存在的HBV特異性CTL是否對(duì)急性排斥的發(fā)生有所影響，本課題對(duì)此做了初步研究。 (一).HBV-DNA與肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)關(guān)系的臨床研究。對(duì)第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院在2003年4月至2005年10月間因乙肝相關(guān)性肝病(HBsAg陽性)實(shí)施同種異體原位肝移植術(shù)的160例病例進(jìn)行分組及統(tǒng)計(jì)分析。圍手術(shù)處理均按醫(yī)院標(biāo)準(zhǔn)的處理方案，急性排斥(acute rejection，AR)的診斷根據(jù)是按19

3、95年banff國際會(huì)議綱要制定的標(biāo)準(zhǔn)，肝穿的組織病理檢查分別按banff分級(jí)計(jì)分。 (二).構(gòu)建檢測(cè)HBv特異性CTL的單鏈MHC-肽四聚體因細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在抑制病毒感染和急性同種移植排斥反應(yīng)等免疫應(yīng)答中起主要作用。因此，了解體內(nèi)抗原特異性的CTL數(shù)量和狀態(tài)有極其重要意義。但由于體內(nèi)抗原特異性CTL的頻度很低，通常不到CD8+總數(shù)的1％，傳統(tǒng)定量方法操作繁瑣且準(zhǔn)確率不高。 四聚體染色(tetramer-staini

4、ng)技術(shù)是最近幾年發(fā)展起來的靈敏度最高、操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單的抗原特異性CTL檢測(cè)方法。T細(xì)胞識(shí)別抗原有MHC限制性，HLA-A0201是我國人群中出現(xiàn)頻率最高的HLAI類基因。實(shí)驗(yàn)中，選擇構(gòu)建HLA-A0201四聚體以篩查廣泛人群；采用基因工程合成技術(shù)，通過一段柔性序列把MHC輕鏈B2 m的C端和。MHC重鏈分子HLAA0201胞外區(qū)N端相連，并在HLA分子胞外區(qū)C端連上15aa的BSP得到重組單鏈MHC分子，以包涵體形式表達(dá)后在HLA

5、限制性表位肽存在下重折疊得到MHC-抗原肽復(fù)合物，生物素化后利用親合素和生物素的特異性結(jié)合，用熒光標(biāo)記的親合素鰲合四個(gè)復(fù)合物分子，成功構(gòu)建獲得能在流式細(xì)胞儀上用于檢測(cè)的四聚體，并驗(yàn)證了它的生物學(xué)有效性?，F(xiàn)有的研究已證實(shí)乙肝病人外周血中病毒特異性的CTL，數(shù)量隨病情嚴(yán)重程度和病程變化而改變，并且不同抗原特異的CTL數(shù)量不同。在本實(shí)驗(yàn)中，選擇分別來自HBV表達(dá)的四種蛋白(核心蛋白 HBC,多聚酶蛋白HBP,外膜蛋白HBS,X蛋白HBX)的抗

6、原肽構(gòu)建成了四種四聚體，以期檢測(cè)時(shí)能全面反映病人體內(nèi)HBV特異性CTL的水平。其中含HBX表位肽的四聚體之前未見報(bào)道。 (三).HBV陽性肝移植病人外周血中HBV特異性CTL的頻度與急性排斥的相關(guān)性研究HBV-DNA是反映病毒復(fù)制的特異性標(biāo)志，在一定范圍內(nèi)HBV-DNA的數(shù)量和病毒特異性CTL數(shù)量相關(guān)。病例回顧已提示病毒載荷升高病人急性排斥率上升，可以推測(cè)病毒特異性CTL可能對(duì)急性排斥有所作用。為證實(shí)這一推測(cè)，我們利用四聚體技術(shù)

7、檢測(cè)了手術(shù)及排斥反應(yīng)前后病人CTL的數(shù)量。 在對(duì)東方肝膽醫(yī)院膽道二科51例接受肝移植治療的 HBV 陽性肝移植病人篩查后，其中HLA-A2+的18例病人入選實(shí)驗(yàn)。分別測(cè)定移植術(shù)前一天和術(shù)后第12天時(shí)病人外周血中針對(duì)HBV表達(dá)四種蛋白的特異性CTL的數(shù)量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，移植病人存在針對(duì)多種抗原的CTL，術(shù)前整體HBV特異性CTL數(shù)量不高，和文獻(xiàn)報(bào)道慢性乙肝病人特異性CTL數(shù)量基本一致。Mann-Whitney U檢驗(yàn)表明