乙肝陽性肝移植病人外周血中HBV特異性CTL頻度和急性排斥發(fā)生關系.pdf

1、盡管免疫抑制劑的發(fā)展使器官移植取得了很大的進步，移植后急性排斥反應仍是肝移植術后的主要障礙之一，長期大量使用免疫抑制劑對各器官遠期功能不利已經成為共識，維持什么水平的免疫抑制甚至是否撤除免疫抑制以及何時撤除免疫抑制?這些問題的解決必須建立在對排斥機制、預測排斥發(fā)生的特異性指標和影響排斥反應的因素等充分了解的基礎上。因為細胞毒性T淋巴細胞在抑制病毒感染、抗腫瘤、急性同種移植排斥反應等免疫應答中起主要作用，而我國接受肝移植的病人大多為乙肝患

2、者，乙肝陽性肝移植病人外周血存在的HBV特異性CTL是否對急性排斥的發(fā)生有所影響，本課題對此做了初步研究。 (一).HBV-DNA與肝移植術后急性排斥反應關系的臨床研究。對第二軍醫(yī)大學附屬東方肝膽外科醫(yī)院在2003年4月至2005年10月間因乙肝相關性肝病(HBsAg陽性)實施同種異體原位肝移植術的160例病例進行分組及統(tǒng)計分析。圍手術處理均按醫(yī)院標準的處理方案，急性排斥(acute rejection，AR)的診斷根據是按19

3、95年banff國際會議綱要制定的標準，肝穿的組織病理檢查分別按banff分級計分。 (二).構建檢測HBv特異性CTL的單鏈MHC-肽四聚體因細胞毒性T淋巴細胞在抑制病毒感染和急性同種移植排斥反應等免疫應答中起主要作用。因此，了解體內抗原特異性的CTL數量和狀態(tài)有極其重要意義。但由于體內抗原特異性CTL的頻度很低，通常不到CD8+總數的1％，傳統(tǒng)定量方法操作繁瑣且準確率不高。 四聚體染色(tetramer-staini

4、ng)技術是最近幾年發(fā)展起來的靈敏度最高、操作相對比較簡單的抗原特異性CTL檢測方法。T細胞識別抗原有MHC限制性，HLA-A0201是我國人群中出現(xiàn)頻率最高的HLAI類基因。實驗中，選擇構建HLA-A0201四聚體以篩查廣泛人群；采用基因工程合成技術，通過一段柔性序列把MHC輕鏈B2 m的C端和。MHC重鏈分子HLAA0201胞外區(qū)N端相連，并在HLA分子胞外區(qū)C端連上15aa的BSP得到重組單鏈MHC分子，以包涵體形式表達后在HLA

5、限制性表位肽存在下重折疊得到MHC-抗原肽復合物，生物素化后利用親合素和生物素的特異性結合，用熒光標記的親合素鰲合四個復合物分子，成功構建獲得能在流式細胞儀上用于檢測的四聚體，并驗證了它的生物學有效性。現(xiàn)有的研究已證實乙肝病人外周血中病毒特異性的CTL，數量隨病情嚴重程度和病程變化而改變，并且不同抗原特異的CTL數量不同。在本實驗中，選擇分別來自HBV表達的四種蛋白(核心蛋白 HBC,多聚酶蛋白HBP,外膜蛋白HBS,X蛋白HBX)的抗

6、原肽構建成了四種四聚體，以期檢測時能全面反映病人體內HBV特異性CTL的水平。其中含HBX表位肽的四聚體之前未見報道。 (三).HBV陽性肝移植病人外周血中HBV特異性CTL的頻度與急性排斥的相關性研究HBV-DNA是反映病毒復制的特異性標志，在一定范圍內HBV-DNA的數量和病毒特異性CTL數量相關。病例回顧已提示病毒載荷升高病人急性排斥率上升，可以推測病毒特異性CTL可能對急性排斥有所作用。為證實這一推測，我們利用四聚體技術

7、檢測了手術及排斥反應前后病人CTL的數量。 在對東方肝膽醫(yī)院膽道二科51例接受肝移植治療的 HBV 陽性肝移植病人篩查后，其中HLA-A2+的18例病人入選實驗。分別測定移植術前一天和術后第12天時病人外周血中針對HBV表達四種蛋白的特異性CTL的數量。 實驗結果顯示，移植病人存在針對多種抗原的CTL，術前整體HBV特異性CTL數量不高，和文獻報道慢性乙肝病人特異性CTL數量基本一致。Mann-Whitney U檢驗表明