番鴨源禽1型副粘病毒P基因克隆及原核表達(dá).pdf

1、禽1型副粘病毒(Avian paramyXOVirus type 1， APMV-1)是副粘病毒科副粘病毒亞科禽腮腺炎病毒屬的成員，是危害養(yǎng)禽業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病病原之一，其代表毒株為新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)。其引起的疫病——新城疫被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類烈性傳染病，因此其病原的研究也成為禽病研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。 2002年以來，我國浙江、福建等省份部分地區(qū)8～40日齡的番鴨發(fā)

2、生一種以表現(xiàn)神經(jīng)癥狀、呼吸困難、腹瀉為主要臨床特征的疫病，發(fā)病率高達(dá)52％，病死率高達(dá)30％，經(jīng)病毒分離鑒定和人工感染試驗(yàn)確定為APMV-1感染。 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank中水禽源禽1型副粘病毒(ZJl)P基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)從福建分離的1株番鴨源APMV-1 (FP1/02株)的基因組中擴(kuò)增出P全基因的cDNA。測(cè)序結(jié)果表明，P基因全長1441nt，包含一個(gè)完整的開放閱讀框架，編碼395個(gè)氨基酸，通過Ge

3、nebank的Blast比對(duì)分析，有40多株病毒P基因序列同源性較高(同源性在80％以上)，其中與PX2/03株、ZJ1株和SF02株的同源性最高，達(dá)97％。同時(shí)借助生物學(xué)軟件及相關(guān)在線分析工具對(duì)測(cè)序完成的P基因進(jìn)行基于氨基酸序列的生物信息學(xué)分析，包括蛋白質(zhì)理化特性、蛋白質(zhì)功能域、基序、空間結(jié)構(gòu)等，分析表明P蛋白無信號(hào)肽、卷曲螺旋等功能區(qū)特征。 以測(cè)序正確的P基因?yàn)槟０澹梅謩e含EcoRI、XhoI的一對(duì)引物對(duì)該目的基因進(jìn)行亞克

4、隆后插入到pGEX-5X-1原核表達(dá)載體中。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和核苷酸序列分析，結(jié)果表明所插入的閱讀框正確，序列無誤，從而成功地構(gòu)建了pGEX-5X-1/P原核表達(dá)載體。 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEX-5X-1/P分別轉(zhuǎn)化E．coli BL21(DE3)宿主菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明pGEX-5X-1/P在E．coli BL21(DE3)獲得了高效表達(dá)，在相應(yīng)位置上(68KD處)可見明顯的目的蛋白表達(dá)帶；

5、重組蛋白主要以可溶性蛋白的形式表達(dá)；GST親和層析純化收集蛋白，純化后的蛋白經(jīng)Western-blot和ELISA初步鑒定能與鴨源禽1型副粘病毒P蛋白陽性血清發(fā)生特異反應(yīng)。本試驗(yàn)成功地克隆了FP1/02株番鴨源APMV-1 P基因完整片段，并實(shí)現(xiàn)了其在原核表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果為研究番鴨源APMV-1 P基因編碼的各蛋白對(duì)不同宿主的免疫原性及在APMV-1跨種間致病等方面的作用和禽1型副粘病毒基因工程疫苗、新型診斷試劑的研制奠