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文檔簡介
1、目的:通過探討番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck movims,MDRV)的分子生物學(xué)特性和免疫學(xué)特性,為建立番鴨呼腸孤病毒病的快速診斷方法提供科學(xué)的技術(shù)資料。 方法:根據(jù)番鴨呼腸孤病毒MW9710分離株序列設(shè)計了兩套PCR.引物,利用番鴨胚成纖維細胞增殖番鴨呼腸孤病毒,提取病毒基因組RNA,用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)對MW9710株病毒oC基因片段進行擴增,連接pMD18-T載體測序驗證后,將產(chǎn)物克隆插入到
2、酵母表達載體pPIC9K中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a中,挑取陽性克隆,獲得酵母表達重組質(zhì)粒pPIC9K-σC。用SacI酶切線性化表達重組質(zhì)粒pPIC9K-σC,電轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞內(nèi),經(jīng)PCR鑒定和G418抗性篩選,獲得了5株pPIC9K-σC酵母陽性整合子,挑取1株進行甲醇誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)pPIC9K-σC酵母整合子經(jīng)誘導(dǎo)表達后在酵母培養(yǎng)基上清中有明顯可見的目的蛋白條帶,分子量大小與預(yù)期相符合,而
3、未重組的酵母空載體中在經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達后的上清中沒有相應(yīng)的蛋白條帶,經(jīng)檢測驗證表達量可達40mg/L。 結(jié)果:(1)成功構(gòu)建番鴨呼腸孤病毒MW9710株σC基因巴斯德畢赤酵母表達體系。(2)證明了目的σC蛋白在巴斯德畢赤酵母中能夠有效地表達并大量分泌。(3)以番鴨呼腸孤病毒陽性血清為一抗和.AP酶標記的羊抗鴨IgG為二抗,通過Western Blot檢測表達產(chǎn)物σC蛋白的活性,表明了表達產(chǎn)物σC蛋白具有免疫活性。(4)通過間接EL
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