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文檔簡(jiǎn)介
1、慢性疼痛的治療一直是臨床的難點(diǎn),冷刺激可以緩解慢性疼痛并可避免常用鎮(zhèn)痛藥物的副作用,但過度的冷刺激卻可誘發(fā)疼痛和冷覺過敏。TRPs通道是位于細(xì)胞膜上的一類重要的陽離子通道,在慢性疼痛中發(fā)揮重要作用,是近年研究的熱點(diǎn)。TRPM8是TRPs通道家族的重要成員,主要感知冷刺激,可被包括薄荷醇、icilin等在內(nèi)多種涼性化合物及低溫(<28C)激活。TRPM8的確定為研究冷刺激與疼痛的關(guān)系提供了新的途徑和手段。本研究以建立關(guān)節(jié)炎大鼠模型為基礎(chǔ),
2、通過薄荷醇及TRPM8反義寡核苷酸激活或者抑制TRPM8,著重探討TRPM8在慢性炎性疼痛大鼠中的作用。期望這些研究結(jié)果能為日后相關(guān)炎性疼痛研究及治療提供依據(jù)。
第一部分:關(guān)節(jié)炎大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPM8表達(dá)的變化
目的:建立完全弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠,觀察其背根神經(jīng)節(jié)TRPM8的表達(dá)變化,以探討TRPM8在冷覺過敏形成中的意義。
方法:將30只健康雄性SD大鼠,體重300±20g,隨機(jī)分成5組(n=
3、6),制成弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎模型,分別為關(guān)節(jié)炎1天組(CFA-1組)、關(guān)節(jié)炎4天組(CFA-4組)、關(guān)節(jié)炎7天組(CFA-7組)、關(guān)節(jié)炎10天組(CFA-10組)、關(guān)節(jié)炎14天組(CFA-14組);將30只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成5組(n=6),制成對(duì)照模型,分別為對(duì)照1天組(NS-1組)、對(duì)照4天組(NS-4組)、對(duì)照7天組(NS-7組)、對(duì)照10天組(NS-10組)、對(duì)照14天組(NS-14組)。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠行為學(xué)指標(biāo),以免疫組織化學(xué)方
4、法檢測(cè)大鼠DRG的TRPM8表達(dá)。
結(jié)果:模型建立后隨著時(shí)間的推移,大鼠右側(cè)L5DRG的TRPM8表達(dá)上調(diào),CFA-7組、CFA-10組、CFA-14組三組大鼠TRPM8表達(dá)水平達(dá)到峰值。對(duì)照組DRG的TRPM8表達(dá)沒有變化。
結(jié)論:DRG內(nèi)TRPM8可能參與冷覺過敏的形成機(jī)制。
第二部分:薄荷醇和TRPM8反義寡核苷酸對(duì)慢性關(guān)節(jié)炎大鼠痛覺過敏和背根神經(jīng)節(jié)TRPM8表達(dá)的影響
目的
5、:建立完全弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型,觀察薄荷醇、反義寡核苷酸對(duì)大鼠行為學(xué)的影響以及背根神經(jīng)節(jié)TRPM8的表達(dá)變化,以探討TRPM8在慢性炎性痛大鼠中的作用。
方法:健康雄性SD大鼠,體重300±20g,行鞘內(nèi)置管,隨機(jī)分成8組(n=8),其中4組制成弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎模型,鞘內(nèi)分別給予薄荷醇100μg/kg(CFA-Menthol組)、生理鹽水20μl(CFA-NS組)、反義寡核苷酸60μg/kg(CFA-Antisense組)
6、、錯(cuò)義寡核苷酸60μg/kg(CFA-Missense組);另外4組制成對(duì)照組(假炎癥組),鞘內(nèi)分別給予薄荷醇100μg/kg(NS-Menthol組)、生理鹽水20μl(NS-NS組)、反義寡核苷酸60μg/kg(NS-Antisense組)、錯(cuò)義寡核苷酸60μg/kg(NS-Missense組)。其中,CFA-Menthol組、CFA-NS組、NS-Menthol組、NS-NS組大鼠致炎后第14天給藥1次;CFA-Antisense
7、組、CFA-Missense組、NS-Antisense組、NS-Missense組致炎后第9天給藥,每天2次,連續(xù)5天。動(dòng)態(tài)檢測(cè)大鼠冷板指標(biāo)、機(jī)械縮爪閾值及熱板縮爪潛伏期。采用免疫組化、westernblot檢測(cè)以上各組右側(cè)L5DRG內(nèi)TRPM8的表達(dá)。
結(jié)果:CFA-Menthol組大鼠鞘內(nèi)給予薄荷醇后冷覺過敏增強(qiáng),熱痛敏和機(jī)械痛敏有所逆轉(zhuǎn);CFA-Antisense組大鼠冷覺過敏有所緩解。免疫組化及western結(jié)果
8、顯示,CFA-Menthol組、CFA-NS組以及CFA-Missense組致炎大鼠右L5DRG內(nèi)TRPM8表達(dá)上調(diào),鞘內(nèi)給予反義寡核苷酸的CFA-Antisense組、NS-Antisense組大鼠右L5DRG內(nèi)TRPM8表達(dá)下調(diào)。
結(jié)論:鞘內(nèi)給予薄荷醇激活表達(dá)上調(diào)的TRPM8使致炎大鼠冷覺過敏增強(qiáng),熱、機(jī)械痛敏逆轉(zhuǎn);鞘內(nèi)給予反義寡核苷酸阻斷TRPM8表達(dá),使致炎大鼠冷覺過敏有所緩解,而對(duì)非致炎大鼠的行為學(xué)沒有影響。慢性
9、炎性疼痛大鼠的冷覺過敏的變化與TRPM8表達(dá)變化有關(guān),薄荷醇的鎮(zhèn)痛作用與TRPM8表達(dá)上調(diào)有關(guān)。
第三部分:薄荷醇、TRPM8反義寡核苷酸的ED50、ED95的測(cè)定
目的:建立完全弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型,測(cè)量大鼠對(duì)薄荷醇、反義寡核苷酸反應(yīng)的ED50、ED95,以探討其在炎性痛大鼠中的量效關(guān)系。
方法:健康雄性SD大鼠,體重300±20g,行鞘內(nèi)置管,隨機(jī)分為14組(n=10),制成弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎
10、模型,其中7組第14天鞘內(nèi)分別給予生理鹽水20μl、薄荷醇31.62μg/kg、39.81μg/kg、50.12μg/kg、63.10μg/kg、79.43μg/kg、100.00μg/kg;另7組致炎后第9天鞘內(nèi)分別給予生理鹽水20μl、反義寡核苷酸18.97μg/kg、23.89μg/kg、30.07μg/kg、37.86μg/kg、47.66μg/kg、60.00μg/kg,每天2次,連續(xù)5天;第14天冷板測(cè)量大鼠右后足抬足次數(shù),
11、以鹽水對(duì)照組抬足次數(shù)為標(biāo)準(zhǔn),薄荷醇組升高30%記為有效,反義寡核苷酸組降低30%記為有效。按Probit模型分別計(jì)算薄荷醇、反義寡核苷酸的ED50及ED95。
結(jié)果:薄荷醇的ED50、ED95分別為:53.36μg/kg、88.31μg/kg;反義寡核苷酸的ED50、ED95分別為:29.92μg/kg、50.36μg/kg。
結(jié)論:薄荷醇的ED50、ED95分別為:53.36μg/kg、88.31μg/kg
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